Data wykonania ćwiczenia: 2.11.2009

Sekcja 10 Aleksandra  Gatlik, Jan Idzik

Grupa Aut2

Sprawozdanie

Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym denaturującym.

Wstep teoretyczny.

Elektroforeza SDS-PAGE (Poliacrylamide Gel Electrophoresis) w warunkach denaturujących jest powszechnie wykorzystywaną techniką w laboratorium, umożliwiającą analizę białek. Cząsteczka białka obdarzona  ładunkiem zdolna jest do poruszania się w polu elektrycznym. SADS-PAGE umożliwia rozdział białek w żelu poliakrylamidowym ze względu na ich masę cząsteczkową. Aby było to jednak możliwe białka naniesione na żel muszą być wpierw zdenaturowane pod wpływem czynnikow redukujących, wysokiej temperatury oraz silnie ujemnego detergentu SDS (siarczan dodecylu) nadającego białkom ujemny ładunek. Takie białka nie posiadają już struktur wyższego rzędu (II, III, IV), lecz liniową strukturę I-rzędową, w ktorej aminokwasy połączone są jedynie wiązaniami peptydowymi.

              Mieszanina akrylamidu pod wpływem APS (nadsiarczan amonu)i katalizatora TEMED tworzą stała sieć tuneli, w ktorych wędrują  białka o rożnej masie cząsteczkowej. W zależności od ich wielkości migrują one z rożna szybkością w polu elektrycznym. Małe białka wędrują do anody

szybciej niż białka o wyższej masie cząsteczkowej.

Odczynniki  użyte w ćwiczeniu:

o        Preparaty z ekstraktów cytoplazmatycznych i jądrowych izolowane na ćwiczeniu 1

o        Preparaty z izolacji białek wiążących DNA (wszystkie frakcje) z ćwiczenia 2

o        Żel rozdzielający 12%

o        Żel zagęszczający

o          Bufor obciążający 6x stężony:
60% glicerol; 300 mM Tris:HCl pH 6.8; 12 mM EDTA; 12% SDS; 864 mM 2-merkaptoetanol; 0.05% błękit bromofenolowy

o        Bufor do elektroforezy:
192 mM glicyna; 0.1% SDS; 25 mM Tris:HCl pH 8.3

o        Markery białkowe „prestained”(Fermentas)

o        Barwnik do żelu:

0,25 g Coomassie Blue R; 45 ml H2O; 45 ml metanolu; 10 ml kwasu octowego 99.9%

o        Odbarwiacz do żelu:

750 ml H2O; 150 ml metanolu; 100 ml kwasu octowego 99.9%

Wykonanie ćwiczenia:

1.    Wylewanie żelu

o       Złożożono szyby – jedną zawierająca odstępniki, drugą gładką – spięto klipsami
i zamocowano  na podstawce. Włożono  grzebień i zaznaczono pisakiem granicę żelu rozdzielającego na 0.5 cm od dolnej granicy grzebienia.

o     Przygotowano wg. instrukcji 7 ml 12% żelu żelu poliakrylamidowego bez dodatku TEMED. Przeniesiono  do osobnej probówki 1 ml roztworu, dodano 2 μl TEMED, wylano przy pomocy pipety automatycznej (1000 μl) pomiędzy szyby i odczekno , aż spolimeryzuje.

o      Do pozostałej mieszaniny dodano 4 μl TEMED, od razu wylano  pomiędzy szyby
do zaznaczonego poziomu. Na powierzchnię niespolimeryzowanego żelu naniesiono  bardzo ostrożnie 1 ml H2O. Pozostawiono  do spolimeryzowania.

o      Przygotowano 2 ml żelu zagęszczającego wg. instrukcji, bez dodatku TEMED. Po spolimeryzowaniu żelu rozdzielającego, wylano wodę i wysuszono szyby bibułą. Do przygotowanego żelu dodano 2 μl TEMED, od razu wylano pomiędzy szyby do utworzenia menisku wypukłego, włożyono delikatnie grzebień tak, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pozostawiono do spolimeryzowania.

2.    Przygotowanie preparatów (w czasie oczekiwaniu na spolimeryzowanie żelu).

o        Podpisano probówki numerami 1-7. Z preparatów EC (ekstrakt cytoplazmatyczny) i EJ (ekstrakt jądrowy) pobrano po 20 μg białka:

Obliczenia:

Wyniki z pierwszego ćwiczenia:

Stężenie białka w:

EC = 5,26 [mg/ml]

EJ = 3,14[mg/ml]

Obliczono objętość pobrania  do sporządzenia próby do elektroforezy:

Dla EC:

              xml=20mg5,26mgml=3,8ml

Dla EJ:

              xml=20mg3,14[mgml]=6,36ml

Wiadomo, że w próbce z ekstraktem jądrowym jest 0,4 M NaCl, żeby doprowadzić, aby stężenie w próbce wynosiło 0,2 M NaCl dajemy do probówki taką samą ilość wody, i dopełniamy do reszty 0,2M NaCl, żeby końcowa objętość wynosiła 15 ml.

              6,26+6,26= 12,72ml     15-12,72=2,28 ml 0,2 M NaCl

Metodą prób I błędów obliczono że trzeba dodać 1 ml  1M NaCl do ekstraktu cytoplazmatycznego i dopełnić  0,2 M NaCl, żeby końcowa objętość wynosiła 15 ml.

              3,8 +1= 4,8 ml         15-4,8= 10,2 ml 0,2 M NaCl

o        Pobrano 15 ml preparatu EC-NZ o stężeniu 0,19116 µg/µl  (do probówki nr 4 od sekcji Katarzyny Jonak i Aldony Jarosz) . Ze wszystkich frakcji pobrano po 20 μl preparatów kolejno do probówek: 5 (F1), 6 (F2) i 7 (F6).

Dla EC – NZ:

µg= 0,19116×0,15µl=0,02 µg

- dla białek niespecyficznie związanych z DNA-celulozą (EJ-F1): 0.05 μg/μl 

μg=0.05 ×0.20=0.01

- dla białek specyficznie związanych z DNA-celulozą (EJ-F2): 0.047 μg/μl

μg=0.047×0.20=0.0094

Gdzie:

EJ-NZ – ekstrakt jądrowy niezwiązany z DNA celulozy

F1- białka niespecyficznie związane z DNA-celulozą

F2- białka  niespecyficznie związane z DNA-celulozą

F6-

o&#x...