4-Oksydoreduktazy.pdf

Ę wiczenie 6

OKSYDOREDUKTAZY

Cz ħĻę do Ļ wiadczalna obejmuje:

−

wykrywanie aktywno Ļ ci katalazy, peroksydazy, oksydazy polifenolowej i oksydazy cyto-

chromowej w ekstrakcie z bulwy ziemniaka

WPROWADZENIE

Oksydoreduktazy katalizuj Ģ przeniesienie równowa Ň ników redukcyjnych mi ħ dzy

dwoma układami redoks. Termin równowa Ň nik redukcyjny okre Ļ la kombinacj ħ elektronów i

protonów, które pojawiaj Ģ si ħ w procesach redoks (Ryc. 1).

Ryc. 1. Równowa Ň niki redukcyjne w biologicznych układach redoks

Procesy oksydacyjno-redukcyjne w komórkach zachodz Ģ we wszystkich przedziałach

subkomórkowych (cytozolu, wewn ħ trznej błonie mitochondriów, w błonie tylakoidów, błonach

siateczki Ļ ródplazmatycznej, błonie j Ģ drowej, a tak Ň e w przestrzeni mi ħ dzykomórkowej). Pro-

cesy te s Ģ katalizowane przez enzymy współdziałaj Ģ ce z rozpuszczalnymi (koenzymy) lub

zwi Ģ zanymi z białkiem enzymatycznym (grupy prostetyczne) kofaktorami . Najwa Ň niejszymi

kofaktorami oksydoreduktaz s Ģ : NAD + , NADP + , FMN, FAD, ubichinon (koenzym Q), plasto-

chinon, plastocyjanina, lipoamid, hem oraz kilka rodzajów centrów Ň elazowo-siarkowych.

Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NAD + ) oraz jego forma ufosforylowana – fosforan

dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADP + ), koenzymy przenosz Ģ ce jony wodorkowe

(2e - i 1H + ) (Ryc. 2A), wykorzystywane s Ģ przez ponad 200 oksydoreduktaz. W utlenionej for-

mie tych koenzymów w pier Ļ cieniu aromatycznym amidu kwasu nikotynowego dodatnie ła-

dunki s Ģ zdelokalizowane (Ryc. 2B). Jedna z dwóch przechodz Ģ cych w siebie struktur ma w

poło Ň eniu para do atomu azotu ubogi w elektrony, dodatnio naładowany atom w ħ gla . W to

miejsce zostaje wprowadzony jon wodorkowy, tworz Ģ c zredukowane formy NADH-H + i

NADPH-H + . Poprawny zapis zredukowanych koenzymów pokazuje, Ň e przyj ħ ciu jonu wodor-

kowego przez koenzym towarzyszy uwolnienie protonu.

Ryc. 2 . Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy. A – ogólny wzór NADH.H + , B - przył Ģ czenie

jonu wodorkowego do w ħ gla w pier Ļ cieniu kwasu nikotynowego (Koolman i Röhm, 2005)

Powstawanie nadtlenku wodoru (H 2 O 2 ) w komórce

W komórce nadtlenek wodoru powstaje w wielu ró Ň nych reakcjach. Jednym z jego Ņ ró-

deł jest reakcja katalizowana przez dysmutaz ħ ponadtlenkow Ģ – enzym usuwaj Ģ cy aniony

ponadtlenkowe zgodnie z reakcj Ģ :

O - 2 + O - 2 + 2H + ® H 2 O 2 + O 2

Anion ponadtlenkowy ( O - 2 ) jest produktem ubocznym wielu reakcji redoks powstaj Ģ cym w

wyniku cz ħĻ ciowej redukcji tlenu cz Ģ steczkowego (przyj ħ cie jednego elektronu). W komórkach

ro Ļ lin aniony ponadtlenkowe powstaj Ģ np. jako produkty uboczne przepływu elektronów przez

centra Ň elazowo-siarkowe (reakcja Mehlera) w obr ħ bie fotosystemu I, czy w reakcji katalizo-

wanej przez oksydaz ħ NADPH.H + zlokalizowan Ģ w błonie komórkowej, gdzie aktywne formy

tlenu słu ŇĢ do obrony przed patogennymi drobnoustrojami.

Wa Ň nymi enzymami wytwarzaj Ģ cymi H 2 O 2 s Ģ tak Ň e oksydazy flawoproteinowe , do

których nale ŇĢ m. in. oksydazy L-aminokwasowe i D-aminokwasowe. Utlenianie aminokwasu

przebiega zgodnie z reakcj Ģ :

aminokwas + O 2 + H 2 O ® ketokwas + H 2 O 2 + NH 3

W komórkach zwierz Ģ t H 2 O 2 powstaje tak Ň e w peroksysomach w reakcji utleniania

kwasów tłuszczowych o dłu Ň szym ni Ň 18C ła ı cuchu w ħ glowodorowym. W tym wypadku szlak

b -oksydacji , podobnie jak utlenianie kwasów tłuszczowych u ro Ļ lin, rozpoczyna si ħ od reakcji

katalizowanej przez oksydaz ħ acylo-CoA zgodnie z równaniem:

acylo-CoA + O 2 ® Ș 2 –enoilo-CoA + H 2 O 2

Bogatym Ņ ródłem H 2 O 2 w komórkach ro Ļ lin jest szlak przemian okre Ļ lany jako fotood-

dychanie . Enzym „rubisco” ( karboksylaza/oksygenaza rybulozo-1,5-bisfosforanu ) mo Ň e do

rybulozo-1,5-bisfosforanu przył Ģ cza ę CO 2 lub O 2 . W pierwszym wypadku powstaj Ģ 2 cz Ģ stecz-

ki kwasu 3-fosfoglicerynowego, natomiast w reakcji, w której zamiast CO 2 uczestniczy O 2

powstaje 1 cz Ģ steczka kwasu fosfoglicerynowego i 1 cz Ģ steczka kwasu 2-fosfoglikolanowego.

Powstaj Ģ cy w chloroplastach 2-fosfoglikolan jest najpierw defosforylowany, a nast ħ pnie po-

wstaj Ģ cy glikolan w peroksysomach zostaje utleniony przez oksydaz ħ glikolanow Ģ do glioksa-

lanu zgodnie z reakcj Ģ :

glikolan + O 2 ® glioksalan + H 2 O 2

Nadtlenek wodoru jest zwi Ģ zkiem szkodliwym, głównie ze wzgl ħ du na mo Ň liwo Ļę po-

wstawania w obecno Ļ ci Fe 2+ rodników hydroksylowych . OH , a tak Ň e tlenu singletowego 1 O 2 .

Enzymatyczne usuwanie H 2 O 2

Enzymami funkcjonuj Ģ cymi w usuwaniu H 2 O 2 s Ģ katalaza i peroksydaza. Katalaza , en-

zym zawieraj Ģ cy hem, dysproporcjonuje dwie cz Ģ steczki H 2 O 2 do H 2 O i O 2 zgodnie z równa-

niem:

2 H 2 O 2 ® 2H 2 O + O 2

Katalazy mog Ģ tak Ň e wykazywa ę aktywno Ļę peroksydacyjn Ģ , w której H 2 O 2 jest wykorzysty-

wany do utleniania alkoholi, aldehydów, fenoli czy azotynów.

Peroksydazy redukuj Ģ nadtlenek wodoru równocze Ļ nie utleniaj Ģ c (odwodorowuj Ģ c)

ró Ň ne substraty. Reakcj ħ katalizowan Ģ przez peroksydazy mo Ň na zapisa ę :

SH 2 + H 2 O 2 ® S + 2H 2 O

SH 2 i S to, odpowiednio, substrat w stanie zredukowanym i utlenionym . Grup Ģ prostetyczn Ģ

peroksydaz ro Ļ linnych jest Ň elazoprotoporfiryna (hemina), natomiast enzymy zwierz ħ ce zawie-

raj Ģ inny typ heminy. Wa Ň n Ģ funkcj ħ ochronn Ģ w komórkach zwierz Ģ t i ro Ļ lin spełnia perok-

sydaza glutationowa współdziałaj Ģ ca z glutationem w usuwaniu nadtlenku wodoru i szkodli-

wych nadtlenków organicznych. W centrum aktywnym tego enzymu wyst ħ puje analog cysteiny

(selenocysteina), w którym siarka została zast Ģ piona selenem.

Oksydazy fenolowe – przenosz Ģ elektrony i protony z orto - lub para -dwufenoli na tlen. Oksy-

daza o -dwufenolwa poza utlenianiem o -dwufenolu katalizuje tak Ň e reakcj ħ hydroksylacja.

Oksydaza cytochromowa (EC 1.9.3.1) – ko ı cowe ogniwo ła ı cucha transportu elektronów

zlokalizowanego w wewn ħ trznej błonie mitochondriów

Ła ı cuch oddechowy katalizuje transport elektronów z NADH-H + lub zredukowanego

ubichinonu na tlen cz Ģ steczkowy . Ubichinon mo Ň e by ę redukowany enzymatycznie w reak-

cjach, w których np. utleniany jest bursztynian b Ģ d Ņ flawoproteina (ETF) redukowana przez

dehydrogenaz ħ acylo-CoA, dehydrogenaz ħ 3-fosfoglicerynianu lub dehydrogenazy utleniaj Ģ ce

cholin ħ czy dihydroorotan. Wi ħ ksza cz ħĻę energii towarzysz Ģ ca reakcjom redoks wykorzysty-

wana jest do formowania w poprzek wewn ħ trznej błony mitochondrialnej gradientu protono-

wego , który z kolei nap ħ dza syntez ħ ATP katalizowan Ģ przez syntaz ħ ATP. Ła ı cuch odde-

chowy obejmuje 3 białkowe kompleksy (kompleks I, III i IV) oraz dwie cz Ģ steczki przeno Ļ ni-

kowe: ubichinon (Q) i cytochrom c (Ryc. 3). Poza tym, z błon Ģ wewn ħ trzn Ģ zwi Ģ zana jest

dehydrogenaza bursztynianowa (kompleks II) oraz inne dehydrogenazy przekazuj Ģ ce elek-

trony na ubichinon (Q) (nie pokazano na Ryc. 3).

Ryc. 3. Transport elektronów w ła ı cuchu oddechowym utworzonym przez trzy kompleksy

białkowe i dwa ruchome no Ļ niki (ubichinon i cytochrom c) przenosz Ģ ce elektrony z utleniane-

go substratu na tlen. Transportowi elektronów wzdłu Ň ła ı cucha oddechowego towarzyszy wek-

torowe pompowanie protonów z matriks do przestrzeni mi ħ dzybłonowej (Alberts i wsp. 1999)

Oksydaza cytochromowa przejmuje elektrony z małego białka, cytochromu c , zawie-

raj Ģ cego Ň elazo w układzie hemowym i przekazuje je na tlen cz Ģ steczkowy (Ryc. 3). Do reduk-

cji cz Ģ steczki tlenu (O 2 ) do dwóch cz Ģ steczek wody potrzebne s Ģ 4 elektrony (4 cz Ģ steczki zre-

dukowanego cytochromu c). Przeniesieniu dwóch elektronów przez zwi Ģ zane z enzymem ko-

faktory (dwa jony miedzi: CuA i CuB, jony Ň elaza w dwóch układach hemowych: hem a i hem

a 3 ) towarzyszy wypompowanie z matriks do przestrzeni mi ħ dzybłonowej 4 H + .

WYKONANIE

Odczynniki:

3% roztwór H 2 O 2

Roztwór KCN, UWAGA! KCN jest siln Ģ trucizn Ģ !

Roztwór benzydyny w kwasie octowym

Odczynnik NADI (przygotowa ę bezpo Ļ rednio przed u Ň yciem, mieszaj Ģ c p -fenyleno-

dwuamin ħ z a-naftolem w stosunku 1 : 1 (1 ml + 1 ml)

0,1M bufor fosforanowy o pH 7,4

Bufor fosforanowy o pH 7,4

Roztwór pirokatechiny

Materiał:

Ekstrakt z ziemniaka – obrany i umyty ziemniak utrze ę na tarce. Miazg ħ wło Ň y ę do woreczka

z gazy i zanurzy ę w zlewce zawieraj Ģ cej około 200 ml wody, a nast ħ pnie lekko wycisn Ģę za-

warto Ļę . Roztwór łagodnie wymiesza ę . Po opadni ħ ciu skrobi na dno zlewki, płyn ostro Ň nie zla ę

znad osadu. Uzyskujemy w ten sposób wodny ekstrakt enzymu . Cz ħĻę nads Ģ czu (około 50

ml) przela ę do zlewki i zagotowa ę , a nast ħ pnie zdenaturowany termicznie ekstrakt ostudzi ę

wkładaj Ģ c zlewk ħ do zimnej wody.

Zasada wykrywania katalazy:

Tlen uwolniony w reakcji dysproporcjowania H 2 O 2 katalizowanej przez katalaz ħ , wy-

dzielaj Ģ c si ħ z roztworu powoduje jego silne pienienie:

2 H 2 O 2 ® 2 H 2 O + O 2

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: