W przeciągu ostatnich 18 lat nastąpił wybitny postęp jeśli chodzi o użycie fluorescencji w badaniach DNA. Metody fluorescencyjne są obecnie używane w wielu technologiach, na przykład służą do sekwencjonowania DNA, detekcji hybrydyzacji DNA, restrykcji fragmentów enzymów, oraz do fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) (używanej do detekcji molekuł za pomocą systemu sparowanych przeciwciał i fluorochromów). Ze względu na szybkie wprowadzenie nowej technologii DNA zadziwiające jest to, że sekwencjonowanie DNA za pomocą fluorescencji zostało po raz pierwszy zanotowane dopiero 18 lat temu, w 1986 roku. Pragnę w tym rozdziale przedstawić kilka zastosowań fluorescencji w badaniach DNA, opisując używane w tym celu molekuły fluoryzujące oraz podając zasady wykorzystywane w każdej dziedzinie, natomiast nie wchodząc zbyt głęboko w zakres biologii molekularnej i diagnostyki, ze względów praktycznych [1].
Sekwencjonowanie DNA znalazło po raz pierwszy praktyczne zastosowanie w 1977 roku; oryginalna metoda, stosująca selektywną chemiczną degradację DNA, która była następczynią chromatografii i detekcji fragmentów przy pomocy autoradiografii 32P. W tym samym roku dostępna stała się również ulepszona metoda bazująca na terminacji łańcucha dideoksynukleotydów i 32P.
Podstawa idei sekwencjonowania przy użyciu terminatorów syntezy (odcinków genu, na których kończy się transkrypcja) trifosforanów dideoksynukleotydów (ddNTP - dideoxynucleoside triphosphates), jest pokazana na rys. 3.1 i 3.2. W łańcuchu DNA nukleotydy są połączone w ciągłą nić przez 5’- i 3’- hydroksylowe grupy cukru, którym jest pentoza. DNA jest replikowane (podwajane) przez dodawanie nukleotydów do grupy 3’- hydroksylowej. Ta reakcja wydłużania jest katalizowana przez nieznaną sekwencję polimerazy DNA, poczynając od pierwszego położenia o znanej sekwencji. W przykładzie pokazanym na rys. 3.2, pojedynczy fluorescencyjny primer (krótki odcinek RNA, do którego jest dobudowywana cząsteczka DNA w czasie replikacji DNA) o znanej sekwencji jest użyty do inicjacji reakcji. Produkt reakcji jest dzielony na cztery części przez cztery zasady. Reakcja polimerazy DNA jest przypadkowo terminowana przez sekwencję ddNTP, które są dodawane wzdłuż wydłużającego się łańcucha. Nieobecność grupy 3’-hydroksylowej w ddNTP zapobiega późniejszemu wydłużeniu i powoduje terminację tej reakcji. To sprawia, że mieszanina zawiera nukleotydy o różnej długości, które są oddzielane za pomocą poliakrylamidowej elektroforezy żelowej. Zwłaszcza mogą być analizowane liczne fragmenty różniące się tylko jedną parą zasad, wśród aż do kilku tysięcy zasad. Właściwie istnieją cztery różnie terminowane nukleotydy, a każda mieszanina reakcyjna jest elektroforezowana na oddzielnym torze. Żele oddzielają fragmenty DNA zgodnie z ich wielkością, tak więc sekwencja może być zależna od autoradiogramu (zaczernionego pod wpływem promieniowania własnego materiału światłoczułego) wydzielonych fragmentów DNA.
Rys. 3.1. Schemat trifosforanu dideoksynukleotydu (ddNTP).
Grupa 2’ jest wodorem w DNA i grupą hydroksylową w RNA [1].
Użycie terminatorów ddNTP jest preferowaną metodą sekwencjonowania, ale obecnie z wykorzystaniem fosforescencji zamiast 32P, ponieważ użycie źródeł radioaktywnych jest problematyczne ze względu na koszty, bezpieczeństwo oraz rozpad. Sekwencjonowanie DNA przy użyciu fluorescencji stało się możliwe w 1986 roku. Zaproponowanych zostało kilka metod, pierwsza bazowała na wykorzystaniu czterech różnych fluoryzujących primerów i niefluoryzujących dideoksynukleotydów, inna opierała się na użyciu czterech różnych fluorescencyjnych dideoksynukleotydów. Sekwencjonowanie DNA może być również dokonane z pojedynczym primerem fluorescencyjnym oraz niefluoryzującymi ddNTP. Skutkiem tego, na rys. 3.2, oba primery lub ddNTP mogą fluoryzować. Jeśli fluorofory są bardzo odmienne, DNA może być elektroforezowane na pojedynczym torze, a sekwencja nukleotydów zidentyfikowana przy pomocy widma emisji. Można również użyć pojedynczego primera fluorescencyjnego i niefluorescencyjnych ddNTP i dokonać elektroforezy na czterech torach, jak pokazano na rys. 3.2. Nukleotyd obecny w każdej pozycji w sekwencji jest wtedy identyfikowany w obecności fluorescencyjnego primera w każdej pozycji w czterech torach, z których każdy jest terminowany innym niefluorescencyjnym ddNTP. Kilka takich mutacji badań jest w obecnym użyciu w sekwencjonowaniu DNA.
Rys. 3.2. Użycie ddNTP i fluorescencyjnych primerów do syntezy DNA. Sekwencjonowanie może być również przeprowadzone na pojedynczym torze z użyciem czterech różnie fluoryzujących ddNTP [1].
Do sekwencjonowania DNA można dobierać wiele fluoroforów, zwłaszcza zbiór czterech fluoroforów, jeden na każdą z zasad, A, C, G i T. Fluorofory są tak dobierane, że wszystkie mogą być wzbudzane przy użyciu wiązki 488 nm. z lasera argonowego. Wstępna seria fluoroforów używanych dla czterech różnych primerów jest pokazana na rys. 3.3.A. Chociaż wszystkie cztery barwniki mogą być wzbudzane wiązką 488 nm., absorpcja Texas Red i tetrametylorodaminy jest oczywiście słabsza niż 488 nm. Z tego powodu jest konieczne użycie wzbudzenia 514 nm. aby uzyskać względnie równą intensywność dla każdej z czterech próbek. Inną trudnością dla tych czterech barwników jest zachodzenie na siebie widm emisji. Dlatego konieczny jest zapis widma emisji z żeli przy więcej niż jednej fali wzbudzenia i emisji. Wbrew tym niedogodnościom, użycie czterech fluoroforów pozwala na zastosowanie pojedynczej kolumny żelowej zawierającej mieszaninę oznakowanych fragmentów DNA.
Nieco ulepszone serie barwników zostały spreparowane do użycia jako fluorescencyjne dideoksy terminatory. Struktura tych barwników jest pokazana na rys. 3.3.B. Należy zwrócić uwagę na nieobecność grupy hydroksylowej w pozycji 3’ cukru. Ten nukleotydowy analog jest niezdolny do wydłużania łańcucha DNA. Wszystkie takie barwniki wykazują podobny współczynnik ekstynkcji w 488 nm., pozwalając na użycie pojedynczej fali wzbudzenia. Jednakże widma emisji zachodzą na siebie, więc detekcja fluorescencji musi być dokonana przez co najmniej dwa filtry, które przepuszczają pasmo, aby zidentyfikować pary zasad.
Jeśli chodzi o własności spektralne barwników służących do sekwencjonowania DNA, użyteczne jest gdy mogą być one wzbudzane dogodnym źródłem światła i dają przybliżoną intensywność przy wzbudzeniu pojedynczą wiązką światła. Użycie fluorescencji sprawia, że sekwencjonowanie DNA staje się rutyną w wielu laboratoriach. Kapilarna elektroforeza żelowa jest używana w miejsce elektroforezy żelowej na płytkach i umożliwia szybszą separację z ulepszonymi rezultatami. Co nadzwyczaj ciekawe, szereg paralelnych włoskowatych kolumn może uformować falę prowadzącą w kierunku poprzecznego cięcia kolumny. Skutkiem tego wszystkie kolumny mogą być wzbudzane pojedynczą wiązką laserową. Z powodu rozwoju elektroforezy żelowej i kapilarnej, jest obecnie możliwe zidentyfikowanie aż do tysiąca zasad w pojedynczej separacji. Niektóre z kolumn kapilar są opisywane z wydajnością 1000 zasad na godzinę. Inne grupy opisują za pomocą instrumentów z aż do 100 kolumnami kapilar. Stąd jasne jest, że technologia sekwencjonowania ulega dalszym udoskonaleniom.
Rys. 3.3. A. Fluorofory używane do sekwencjonowania DNA przez fluorescencyjne primery – wzory strukturalne i czasy zaniku. B. Fluorescencyjna łańcuchowa terminacja dideoksynukleotydów.
Litery określają zasadę DNA, a numery – maksimum emisji [1].
Sekwencjonowanie DNA sondami podczerwonymi (NIR)
Ze względu na badania nad określeniem ludzkiego genomu, ważne jest aby sekwencjonować DNA tak szybko i przy tak niewielkich kosztach jak to jest tylko możliwe. Jedną metodą na zmniejszenie kosztów jest użycie półprzewodnikowych diod laserowych, które są obecnie dostępne od 630 nm. do dłuższych zakresów fal. Lasery te pobierają mało mocy i mogą pracować powyżej 100 tys. godzin. Dodatkową zaletą czerwonego i podczerwonego wzbudzenia jest mała autofluorescencja z próbek biologicznych, żeli, rozpuszczalników i komponentów optycznych.
Zalety długości fali podczerwonej dla sekwencjonowania DNA są oczywiste i kilka grup kwalifikuje barwniki podczerwone do sekwencjonowania DNA. Wzbudzenie może być osiągane w podczerwieni w 785 nm., a emisja pojawia się przy 810 nm. Takie barwniki często wykazują małe przesunięcie Stokesowskie, co ma swój rezultat w problemach z zarejestrowaniem rozproszonego wzbudzenia. Przesunięcie Stokesowskie może być większe przy użyciu par donor-akceptor.
W przeszłości wiele przyrządów do sekwencjonowania było projektowanych na bazie spektralnych własności dostępnych sond. Jednak istnieją znaczące zalety w planowaniu sond przed oprzyrządowaniem. Na przykład, próbniki pokazane na rys 21.3.A potrzebują lasera argonowego w 488 i 5143 nm. dla wzbudzenia. Istniała filozofia w projektowaniu primerów NIR DNA, która z kolei pozwalała planować wrażliwość oraz wytrzymałość urządzenia do określania sekwencji. Długofalowe maksimum absorpcji pozwala na użycie 760nm diody laserowej jako źródła wzbudzenia. Długofalowa emisja może być skutecznie wykrywana za pomocą lawiny fotodiod. Wiązka wzbudzenia pada na talerzyk szklany pod kątem Brewstera, aby zminimalizować rozproszenie światła. Takie urządzenie pokazuje efektywność włączania projektu próbki jako integralnej części procesu planowania oprzyrządowania.
Obecnie zestaw czterech sond NIR dla sekwencjonowania DNA na pojedynczym torze nie wydaje się dostępny, ale własności spektralne wielu barwników NIR są jeszcze znane. Wiele próbników NIR jest używanych jako primery z niefluorescencyjnymi dideoksy terminatorami. Trudne a zarazem wyzywające jest rozwijanie sond dla użycia w sekwencjonowaniu DNA. Barwniki muszą wykazywać podobną intensywność w pojedynczej fali wzbudzenia i nie mogą modyfikować za bardzo elektroforetyczną zdolność znakowanych fragmentów DNA. Chociaż wydaje się możliwe znalezienie czterech czerwono-podczerwonych barwników do sekwencjonowania DNA, każdy z odrębnym widmem emisji, nie zostało to do tej pory zrealizowane.
Sekwencjonowanie DNA na bazie czasu życia
Trudno jest uzyskać cztery barwniki o podobnych widmach absorpcji a różnych widmach emisji. Takie barwniki pozwolą na determinację wszystkich czterech zasad w jednej kolumnie żelowej, co jest bardzo pożądane dla szybszego sekwencjonowania. Użycie czasu zaniku zamiast maksimum emisji oferuje alternatywną metodę identyfikacji zasad. Dodatkową zaletą sekwencjonowania bazującego na czasie życia jest to, że czas zaniku jest bardziej niezależny od intensywności. Jeśli czas zaniku jest używany do identyfikacji zasad, fluorofory z nakładającym się widmem emisji mogą być użyte, ewentualnie ułatwia to identyfikację dogodnych fluoroforów.
Kilka grup zrobiło postępy, jeśli chodzi o sekwencjonowanie na bazie czasu życia. Czas zaniku wstępnie zaproponowanych barwników DNA (rys. 21.3.A) został zmierzony w żelu poliakrylamidowym pod warunkami sekwencjonowania. Czas zaniku jest wyszczególniony na rys. 21.3.A. Chociaż czas zaniku różni się dla każdego barwnika, impulsowe źródło światła w 488 i 514 nm. nie jest praktyczne do sekwencjonowania. Źródło powinno być jonowym laserem argonowym, który jest modulowany zewnętrznie lub wewnętrznie.
Została zaproponowana grupa barwników DNA opartych na czasie życia, wzbudzanych w 636 nm. (rys. 3.4). Czas zaniku ma zakres od 3,6 do 07 ns. Jednakże niektóre z tych barwników są wygaszane po połączeniu do oligonukleotydów. Tym niemniej możliwość uzyskania różnych czasów życia sugeruje, iż ciągłe badania doprowadzą do postępu w sekwencjonowaniu bazującym na czasie życia [1].
Rys. 3.4. Barwniki do sekwencjonowania
bazującego na czasie życia [1].
Detekcja hybrydyzacji DNA jest bardzo użyteczna w biologii molekularnej oraz genetyce. Hybrydyzacja jest podstawą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Wiele metod jest używanych do detekcji hybrydyzacji DNA przez fluorescencję. Wiele z nich opiera się na transferze energii pomiędzy DNA znakowanym donorem i akceptorem. Kilka możliwych metod jest pokazanych schematycznie na rys 3.5.
Obecność komplementarnej sekwencji DNA może być wykryta przez wzrost transferu energii kiedy sekwencja jest przenoszona w pobliże przez hybrydyzację. Może to występować, jeśli komplementarne nicie są znakowana donorami i akceptorami (rys. 3.5a). Transfer energii również występuje, jeśli znakowane donorem i akceptorem oligonukleotydy przyłączają się do przyległych regionów dłuższej sekwencji DNA (rys 3.5b). Hybrydyzacja może być również wykryta, jeśli donor wbudowuje się pomiędzy podwójną helisę DNA i przenosi energię do znakowanego akceptorem oligonukleotydu (rys. 3.5c). Użycie barwników wbudowujących się przez interkalację jest rozciągnięte na włączenie kowalencyjnie połączonych interkalatorów, których fluorescencja wzrasta w obecności podwójnej nici DNA (rys. 3.5d).
Rys. 3.5. Metody do detekcji hybrydyzacji DNA za pomocą transferu energii. D – donor, A – akceptor, I – barwnik interkalacyjny [1].
Istnieje również konkurencyjna hybrydyzacja, (rys. 3.5e) dokonywana na komplementarnych niciach DNA, w których przeciwległe nicie były znakowane fluoresceiną i rodaminą. Hybrydyzacja nici doprowadza do wygaszania fluorescencji donora. Wzrost ilości nieoznakowanego DNA, komplementarny do jednej ze znakowanych nici, powoduje przemieszczenie akceptora i wzrost fluorescencji donora. Takie badania mogą być użyteczne w rozszerzeniu badań, w których DNA jest termicznie denaturowane podczas każdego cyklu.
Wbudowujące się przez interkalację barwniki mogą być również używane do detekcji hybrydyzacji.
...
sklejka