Metody barwienia i morfologia komorki bakteryjnej.doc

Metody barwienia i morfologia komórki bakteryjnej

Budowa komórki bakteryjnej

a)      struktury podstawowe:

§         ściana komórkowa

§         błona cytoplazmatyczna

§         cytoplazma

§         rybosomy

§         nukleoid

b)     struktury dodatkowe:

§         otoczki

§         rzęski

§         fimbrie

§         przetrwalniki

§         wtręty komórkowe

§         plazmidy

STAŁE ELEMENTY KOMÓRKI BAKTERYJNEJ

ŚCIANA KOMÓRKOWA

Zbudowana jest z peptydoglikanu (mureiny). Cząsteczka peptydoglikanu jest zbudowana z długich łańcuchów polisacharydowych, które łączą się w sieć za pomocą mostków peptydowych.

Każdy łańcuch polisacharydowy zbudowany jest z dwucukrów:

® N-acetyloglukozaminy

® Kwasu N-acetylomuraminowego (występuje wyłącznie u organizmów prokariotycznych).

Ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej dzielimy bakterie na Gram – dodatnie i Gram – ujemne.

Bakterie gram-dodatnie mają wielowarstwową ścianę komórkową.

n                    Wszystkich warstw jest zwykle ok. 40 i są one ze sobą połączone poprzecznymi wiązaniami.

n                    Grubość takiej ściany komórkowej wynosi 20-80 nm.

n                    Zbudowana jest z mureiny, kwasów tejchojowych i tejchuronowych oraz kwasów lipotejchojowych.

n                    Składa się w 60-100% z peptydoglikanu tworzącego trójwymiarową sieć.

n                    Kwasy tejchojowe i tejchuronowe przechodzą w poprzek ściany komórkowej - są "wplecione" w mureinę. Podobnie rozmieszczone są kwasy lipotejchojowe, zawierają one jednak dodatkowy komponent tłuszczowy, który zakotwicza je w błonie komórkowej bakterii.

Ściana komórkowa bakterii gram-ujemnych zbudowana jest z pojedynczej warstwy mureiny, której towarzyszą dodatkowe związki chemiczne.

n                     Grubość ściany wynosi 2-10 nm i nie stwierdza się w niej obecności kwasów tejchojowych.

n                     Ściana komórkowa jest otoczona dodatkową strukturą, tzw. błoną zewnętrzną. Zatem praktycznie jedyną funkcją ściany komórek gram-ujemnych jest zapobieganie cytolizie (plazmolizie) wywołanej zmianami ciśnienia osmotycznego.

              Błonę zewnętrzną tworzą: lipopolisacharyd, fosfolipidy i białka.

n                    Lipopolisacharyd (LPS) - endotoksyna:

n                    Efekty biologiczne działania endotoksyn mogą być wielokierunkowe i zróżnicowane.

n                    Heteropolimer zbudowany z trzech składowych:

n   Lipid A

n   Oligocukier rdzeniowy – podobny u wszystkich bakterii Gram – ujemnych, często nazywany antygenem wspólnym (CA – common antigen) lub antygenem Kunina

n   Antygen somatyczny (antygen O): leży najbardziej zewnętrznie, składa się z podjednostek oligocukrowych.

BŁONA CYTOPLAZMATYCZNA

n                     Wykazuje typową dla wszystkich błon elementarnych strukturę trójwarstwową i zbudowana jest z lipidów (20-35%) i białek (50-75%).

NUKLEOID

n                    Obszar komórki prokariotycznej będący odpowiednikiem jądra komórkowego u Eukaryota.

n                    Nie jest oddzielony od cytoplazmy otoczką jądrową.

n                    Zawiera genofor (chromosom bakteryjny), czyli pojedynczą, kolistą cząsteczkę dwuniciowego DNA.

n                    Niektóre funkcje organizmu (np. oporność na antybiotyki, synteza bakteriocyn) są kodowane przez plazmidy – samoreplikujące się, zamknięte, koliste cząsteczki dwuniciowego DNA.

n                    Nukleoid wraz z plazmidami zawiera pełną informację genetyczną komórki.

CYTOPLAZMA

n                    Wodny roztwór związków wielkocząsteczkowych, soli mineralnych, cukrów prostych, aminokwasów, kwasów tłuszczowych i związków wysokoenergetycznych o charakterze koloidu, w którym zawieszone są biologicznie czynne struktury: nukleoid, plazmidy, rybosomy, materiał zapasowy (ziarnistości, wtręty, kryształki, kropelki).

RYBOSOMY

n                    Rybosomy u Prokaryota są mniejsze niż u Eukaryota, mają niższą masę cząsteczkową i stałą sedymentacji Svedberga, wynoszącą 70S.

ZMIENNE ELEMENTY KOMÓRKI BAKTERYJNEJ

Otoczki

n                    Chronią bakterie przed wyschnięciem, ułatwiają adhezję, chronią przed reakcją obronną zakażanego organizmu, mogą być czynnikiem zjadliwości.

n                    Można je uwidocznić pod mikroskopem świetlnym stosując barwniki nie przechodzące przez materiał otoczkowy, np. nigrozynę, czerwień Kongo, tusz chiński. W technice barwienia negatywnego na ciemnym tle preparatu pojawiają się jasne otoczki.

Rzęski

n                    Rzęski są to wyrostki o średnicy 12-18 nm i długości do 20 μm.

n                    Za pomocą ciałka bazalnego są zaczepione jednym końcem w błonie cytoplazmatycznej.

n                    Umiejscowienie i liczba rzęsek jest dla bakterii cechą charakterystyczną i ma znaczenie taksonomiczne.

n                    Obecność i ułożenie rzęsek na komórce:

n      ditrychalne (dwurzęse)

n      monotrychalne (jednorzęse)

n      lophotrychalne (czuborzęse)

n      jednobiegunowe

n      dwubiegunowe

n      perytrychalne (wkołorzęse)

Fimbrie i pile

n                    Niektóre bakterie gram-ujemne mogą wytwarzać nitkowate, zakotwiczone w cytoplazmie wyrostki – fimbrie.

n                    Są to długie, cienkie, proste nici o średnicy 3-25 nm, długości do 12 μm.

n                    Grubsze wyrostki, zwane też pilami płciowymi (pilami typu F), służą podczas koniugacji do przenoszenia DNA.

Przetrwalniki (endospory)

§         Niektóre gatunki bakterii mają zdolność wytwarzania przetrwalników (rodzaje: Bacillus, Clostridium)

§         W razie występowania niekorzystnych warunków środowiska rozpoczyna się proces sporulacji, w którym następuje zagęszczenie protoplazmy, ustają procesy metaboliczne, zawartość przetrwalnika jest otaczana grubą ścianą.

§         Przetrwalniki są bardzo odporne na działanie niekorzystnych czynników fizycznych i chemicznych

§         Po zaistnieniu korzystnych warunków środowiskowych rozpoczyna się kiełkowanie (germinacja) przetrwalników.

§         Ułożenie przetrwalników:

§         Centralne

§         Paracentralne

§         Subterminalne

§         Termialne

Opis komórki bakteryjnej (obraz mikroskopowy):

a) wynik barwienia

b) wielkość

c) układ

d) kształt komórki bakteryjnej

e) obecność i ułożenie rzęsek

f) obecność otoczki

g) obecność ciał zapasowych

h) obecność, kształt, wielkość, ułożenie przetrwalników

Wynik barwienia – metody barwienia

Stosowane barwniki możemy podzielić na:

a)          Kwaśne – eozyna, fuksyna kwaśna,

b)          Zasadowe – błękit metylenowy, fuksyna zasadowa.

Barwienie ma na celu:

a)      umożliwić obejrzenie układu przestrzennego morfologii i anatomii komórek

b)     wykazać obecność bakterii w badanym preparacie

Przygotowanie preparatu z hodowli:

1.      Przygotowanie rozmazu na szkiełku podstawowym – pobrać jedną kolonię ezą i rozetrzeć na szkiełku.

2.      Połączyć z kroplą 0,9% NaCl

3.      Pozostawić do wyschnięcia

4.      Utrwalić w płomieniu palnika

Metody barwienia:

§         Proste (jeden barwnik):

o       Pozytywne (barwią się komórki bakteryjne): metoda Löfflera,

o       Negatywne (barwi się tło): barwienie nigrozyną lub tuszem chińskim.

§         Złożone (kilka barwników):

o       Pozytywne (j. w. ): metoda Neissera, metoda Grama, metoda Waysona (do barwienia preparatów bezpośrednich),

o       Pozytywno – negatywne (barwią się elementy komórek bakteryjnych i tło – metoda uwidaczniania otoczek): barwienie otoczek wg Burri – Ginsa, barwienie przetrwalników wg Dornera.

Barwienie metodą Grama:

Fiolet krystaliczny – 2-3 min

Spłukać wodą

Płyn Lugola – 1-2 min

Spłukać wodą

Odbarwiacz

Spłukać wodą

Fuksyna zasadowa - 0,5 min

Spłukać wodą

Wynik barwienia:

Gram dodatnie – fioletowe

Gram ujemne – czerwone

Gram chwiejne – czerwono- fioletowe (np. Corynebacterium)

1