Skocz do: nawigacji, szukaj
Chromatografia (gr. chromatos = barwa + grapho = pisze) to technika analityczna lub preparatywna służąca do rozdzielania lub badania składu mieszanin związków chemicznych.
W każdej technice chromatograficznej najpierw rozdziela się badaną mieszaninę, a następnie przeprowadza się detekcję poszczególnych składników. Rozdział substancji następuje w wyniku przepuszczenia roztworu badanej mieszaniny przez specjalnie spreparowaną fazę rozdzielczą (złoże), zwaną też fazą stacjonarną. Fazą rozdzielczą są substancje wykazujące zdolności sorpcyjne lub zdolne do innych oddziaływań na substancje przepływające. Podczas przepływu eluenta (fazy ruchomej) przez fazę rozdzielczą następuje proces wymywania zaadsorbowanych (lub związanych) substancji. Intensywność tego procesu jest różna dla poszczególnych składników mieszaniny. Jedne składniki są więc zatrzymywane w fazie dłużej, a inne krócej, dzięki czemu może następować ich separacja. Czas przebywania danego składnika w kolumnie określany jest mianem czasu retencji.
W zależności od rodzaju eluentu czyli substancji w której rozpuszcza się badaną mieszaninę rozróżnia się następujące techniki chromatograficzne:
· chromatografia cieczowa - w której eluentem jest ciekły rozpuszczalnik
· chromatografia gazowa - w której eluentem jest gaz (zwykle wodór lub hel).
· chromatografia nadkrytyczna - w której eluentem jest gaz w stanie nadkrytycznym.
W zależności od rodzaju i sposobu przygotowania fazy rozdzielczej:
· TLC - thin layer chromatography, chromatografia cienkowarstwowa - w której fazę rozdzielczą stanowi cienka warstwa żelu naniesiona na sztywną płytkę. Na tak spreparowaną płytkę nanosi się próbkę roztworu, po czym na skutek działania sił kapilarnych, grawitacji lub pola elektrycznego następuje przepływ i rozdział mieszaniny;
· chromatografia bibułowa - w której fazę rozdzielczą stanowi pasek lub arkusz bibuły filtracyjnej lub specjalnego typu bibuły chromatograficznej;
· chromatografia kolumnowa - w której faza rozdzielcza jest umieszczona w specjalnej kolumnie, przez którą przepuszcza się następnie roztwór badanej mieszaniny. Przepływ roztworu przez kolumnę można wymuszać grawitacyjnie lub stosując różnicę ciśnień na wlocie i wylocie kolumny;
· chromatografia powinowactwa - w której odpowiednio spreparowana faza rozdzielcza jest zdolna do oddziaływań chemicznych o zmiennym powinowactwie wobec rozdzielanych substancji;
· chromatografia jonowymienna - w której substancje oddziaływują ze złożem za pomocą oddziaływań jonowych.
W zależności od parametrów procesu:
· HPLC - high performance/pressure liquid chromatography, wysokosprawna/ciśnieniowa chromatografia cieczowa - odmiana cieczowej chromatografii kolumnowej z użyciem eluenta pod wysokim ciśnieniem;
· FPLC - fast protein/performance liquid chromatography - szybka, białkowa/szybkosprawna chromatografia cieczowa - odmiana HPLC działająca na niższych ciśnieniach, stosująca prócz złóż sorpcyjnych, także zwykłe złoża typu sit molekularnych, służąca głównie do rozdziału białek i polipeptydów. Opatentowana i wyłączna nazwa dla firmy Pharmacia.
Związek chromatografii z badaniem struktury substancji jest dość luźny, niemniej czasami ustalenie struktury związku, szczególnie naturalnego, bez wyizolowania go metodą chromatografii z jego naturalnego otoczenia (tzw. matrycy) byłoby niemożliwe.
Pojęciem chromatografii obejmujemy techniki analityczne wykorzystujące zjawisko różnej szybkości migracji składników analizowanej mieszaniny. Różnica w szybkości migracji poszczególnych składników mieszaniny spowodowana może być przez różne czynniki - rozpuszczalność, współczynnik podziału, adsorpcje, reakcje chemiczne itp. - stąd podstawowy podział technik chromatograficznych na adsorpcyjne, podziałowe i jonowymienne. Nazwa chromatografia ("pisanie barwami") wzięła się od pierwszych doświadczeń w tej dziedzinie rosyjskiego botanika Cwieta, który na początku XX wieku przeprowadzał tą metodą rozdział barwnych związków naturalnych.
Klasyczny układ chromatograficzny to nieruchoma faza stacjonarna, w stosunku do której przesuwa się faza ruchoma. Składniki rozdzielanej mieszaniny wykazują powinowactwo zarówno do fazy stacjonarnej jak i do fazy ruchomej, jednak wielkość tego powinowactwa jest różna dla różnych składników. W efekcie tych różnic konkretny składnik mieszaniny przesuwa się wzdłuż drogi rozwijania chromatogramu tylko wtedy, kiedy znajduje się w fazie ruchomej. Składniki mieszaniny o większym powinowactwie do fazy ruchomej poruszają się zatem szybciej ("częściej" przebywają w fazie ruchomej), składniki o większym powinowactwie do fazy stacjonarnej - wolniej ("częściej" tkwią nieruchomo na fazie stacjonarnej). Ponieważ szybkość migracji każdego składnika mieszaniny jest wypadkową działania dwóch sił (powinowactw do dwóch faz chromatograficznych), dla większości mieszanin dość łatwo dobrać układ faz (układ chromatograficzny), który zapewni takie różnice w szybkości migracji, by możliwe było fizyczne odseparowanie cząsteczek poszczególnych substancji od siebie.
Mieszanina rozdzielanych substancji (czerwone i niebieskie cząsteczki) zostaje naniesiona na punkt startowy na fazie nieruchomej (stacjonarnej)
Rozpoczyna się ruch fazy ruchomej. Na punkt startowy napływa czysta faza ruchoma.
Lepiej rozpuszczalna substancja niebieska w większości przechodzi do fazy ruchomej i wraz z nią wędruje wzdłuż drogi rozwijania chromatogramu. Substancja czerwona o większym powinowactwie do fazy stacjonarnej i słabej rozpuszczalności w fazie ruchomej w większości pozostaje w punkcie startowym na fazie stacjonarnej
Ruch fazy powoduje, że nad punkt 1 napływa czysty rozpuszczalnik, co przyspiesza rozpuszczanie się w nim cząsteczek czerwonych, zaś cząsteczki które wcześniej poruszały się z faza ruchoma znalazły się nad punktem 2, co spowodowało ich częściowe przejście do fazy stacjonarnej, aż do uzyskania stanu równowagi
Kolejne etapy rozwijania chromatogramu to przechodzenie cząsteczek z fazy ruchomej do stacjonarnej w miejscach, gdzie roztwór w fazie ruchomej styka się z "nie zajętą" fazą stacjonarną, oraz przechodzenie cząsteczek z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej tam, gdzie "czysta" faza ruchoma styka się z faza stacjonarną obsadzoną cząsteczkami mieszaniny.
Elementarne procesy przechodzenia z jednej fazy układu chromatograficznego do drugiej odbywają się pod wpływem dwóch czynników - powinowactwa do fazy ruchomej (zdolności rozpuszczania w fazie ruchomej) i powinowactwa do fazy stacjonarnej.
Wypadkowa wartość tych dwóch przeciwstawnych czynników określa średni czas przebywania cząsteczek każdej substancji rozdzielanej mieszaniny w fazie ruchomej. Czas przebywania w fazie ruchomej określa natomiast średnią szybkość migracji wzdłuż drogi rozwijania chromatogramu, bowiem cząsteczki migrują tylko wraz z fazą ruchomą.
Odpowiednio dobrany układ chromatograficzny powoduje uzyskanie takich różnic w szybkości migracji poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny, że odległości między skupiskami poszczególnych cząsteczek po zakończeniu procesu, są wystarczająco duże dla fizycznego odseparowania ich od siebie - dokonania rozdziału chromatograficznego
W najprostszym, schematycznym ujęciu można to przedstawić następująco - cząsteczki czerwone mające silniejsze powinowactwo do fazy stacjonarnej poruszają się "krótszymi krokami" (linia czerwona) niż cząsteczki niebieskie, które szybciej przechodzą do fazy ruchomej i trudniej są z niej wychwytywane przez fazę stacjonarna (linia niebieska)
Techniki
W chwili obecnej proces chromatograficznego rozdzielania możemy przeprowadzać na wiele sposobów, wieloma technikami. Podziału technik chromatograficznych można dokonywać na wiele sposobów, biorąc pod uwagę różne czynniki procesu. Wszystkie podziały są dość umowne i mają jedynie służyć łatwiejszemu porozumiewaniu się "chromatografistów", a nowym adeptom sztuki chromatograficznej maja ułatwić poruszanie się w gąszczu technik i ich odmian.
Ze względu na podstawowe zjawisko fizykochemiczne prowadzące do uzyskania rozdziału składników chromatografowanej mieszaniny wyróżniamy chromatografię adsorpcyjną, podziałową i jonowymienną. Ze względu na rodzaje stosowanych faz dzielimy chromatografię na gazową (faza ruchoma jest gazem), cieczową grawitacyjną (fazą ruchoma jest ciecz przepływająca przez złoże fazy stacjonarnej pod wpływem siły grawitacji) i cieczową ciśnieniową (przepływ fazy wymuszony jest wysokim ciśnieniem wytwarzanym przez specjalne pompy). Inny podział wyróżnia techniki planarne (np. cienkowarstwowa lub bibułowa) i kolumnowe (faza stacjonarna wypełnia szklana lub metalową rurkę - kolumnę). W ostatnich latach coraz częściej stykamy się z pojęciem chromatografii z użyciem odwróconych faz. Ponieważ do tej pory najczęstszym układem chromatograficznym był układ, w którym faza stacjonarna była bardziej polarna (bądź miała większe powinowactwo do substancji polarnych) niż faza ruchoma - układ, w którym faza ruchoma jest bardziej polarna niż stacjonarna uzyskał miano układu faz odwróconych (RP - reverse phase). Konkretną technikę można zazwyczaj zaliczyć do kilku grup jednocześnie, jako że kryteria poszczególnych podziałów najczęściej nie wykluczają się nawzajem.
Adsorpcyjna
O chromatografii adsorpcyjnej mówimy wówczas, gdy głównym zjawiskiem determinującym przebieg procesu chromatograficznego jest zjawisko adsorpcji. Zjawisko to polega z grubsza na tym, że cząsteczka substancji łączy się w sposób nietrwały (głównie siłami o charakterze wiązania wodorowego) z powierzchnia adsorbenta (np. żel krzemionkowy, tlenek glinu). W chwili gdy zaadsorbowana cząsteczka styka się z "czystą" fazą ruchomą następuje zjawisko desorpcji i cząsteczka przechodzi ponownie do fazy ruchomej.
Podziałowa
W chromatografii podziałowej zjawiskiem decydującym o przebiegu procesu jest zjawisko podziału substancji między dwie ciekłe, nie mieszające się fazy. Ciekłą fazę stacjonarną uzyskujemy przez osadzenie na ziarnach stałego nośnika cienkiej warstewki odpowiednio dobranej cieczy (również pod względem parametrów fizycznych, głównie lepkości i związanej z tym siły przylegania - adhezji). Zgodnie z prawem podziału Nernsta, stosunek stężeń w obu fazach w stanie równowagi jest wielkością stałą i charakterystyczną w danych warunkach dla danej substancji. Tak więc, gdy stężenie składnika w fazie ruchomej jest większe, niż to wynika z prawa podziału, substancja przechodzi do fazy ciekłej stacjonarnej. Jeśli po chwili napłynie faza ruchoma o mniejszym stężeniu tej substancji nastąpi częściowe przejście z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej (aż do ustalenia odpowiedniego stosunku stężeń w obu fazach).
Jonowymienna
Jest to typ chromatografii dość znacznie odbiegający od innych. Tu decydującą rolę pełni reakcja chemiczna, i to reakcja z zakresu oddziaływań elektrolitów. Prawie zawsze jest to technika kolumnowa, gdzie wypełnienie kolumny stanowi najczęściej granulowano drobno żywica jonowymienna. Jest to substancja z grupy polimerów, posiadająca na swej powierzchni grupy aktywne chemicznie - najczęściej o charakterze kwaśnym (kwasy sulfonowe) lub zasadowym. Te aktywne grupy chemiczne wychwytują z przepływającego przez kolumnę roztworu kationy lub aniony (w zależności od rodzaju wypełnienie), które później można wymyć z kolumny odpowiednim eluentem. Stosując odpowiednie wypełnienia i eluenty lub łącząc szeregowo kolumny o różnym wypełnieniu można doprowadzić do rozdzielenia mieszaniny kationów lub anionów.
Większe znaczenie żywice jonowymienne maja w przypadku stosowania ich do demineralizacji wody. Woda przepuszczana przed złoże kationitu a później anionitu, zostaje pozbawiona elektrolitów, co w niektórych przypadkach jest konieczne dla sprawnego działania urządzeń (kotły parowe, ogrzewanie wodne itp.). Jest to dość prosta i stosunkowo tania metoda uzdatniania wody. Zużyte kationity i anionity można następnie regenerować, przemywając je kwasem lub zasadą.
GC
Chromatografia gazowa (Gas Chromatography - GC) ma jedno ważne ograniczenie - można ją stosować tylko dla związków lotnych w temperaturze chromatografowania (do ~350°C) i trwałych w tej temperaturze. W praktyce oznacza to najczęściej związki o masie cząsteczkowej poniżej 400 D.
Chromatografowanie przeprowadza się w kolumnie wypełnionej odpowiednim adsorbentem lub ciekłą fazą stacjonarną osadzoną na nośniku. Kolumna w czasie procesu chromatograficznego ogrzana jest do odpowiedniej temperatury. Nastrzyknięta na czoło kolumny mieszanina pod wpływem wysokiej temperatury przechodzi w postać gazową i wraz z gazem nośnym (wodór, azot, hel, itp.), stanowiącym w tej technice fazę ruchomą, przepływa przez kolumnę. Faza stacjonarna wychwytuje cząsteczki z fazy ruchomej poprzez adsorpcje lub rozpuszczanie w fazie ciekłej, a następnie oddaje do fazy ruchomej, zgodnie z zasadami zjawiska adsorpcji-desorpcji lub rozpuszczania gazów. Różna lotność składników analizowanej mieszaniny w połączeniu z różnym powinowactwem do fazy stacjonarnej daje w efekcie rozdzielenie składników.
W chromatografii gazowej dużą role odgrywają detektory, przy pomocy których wykrywamy i oznaczamy opuszczające kolumnę w gazie nośnym składniki mieszaniny. Ze względu na dużą różnorodność chemiczną i fizyczną analizowanych substancji wykorzystuje się wiele detektorów o różnych zasadach działania i bardzo różnej konstrukcji.
HPLC
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC - High Performance Liquid Chromatography; High Pressure Liquid Chromatography) jest dziś najpopularniejszą i najbardziej uniwersalną techniką chromatograficzną. Jest to technika kolumnowa, ciśnieniowa, w której faza ruchoma przepływa przez kolumnę wypełnioną drobnoziarnistą fazą stacjonarną pod dużym ciśnieniem (najczęściej 200-400 atm). Dzięki temu faza stacjonarna może być drobnoziarnista i gęsto upakowana (duża powierzchnia styku z fazą ruchomą, ale i duże opory dla przepływu fazy ruchomej), a faza ruchoma przepływać z prędkością kilku- kilkunastu mililitrów na minutę (w standardowych kolumnach) co pozwala skrócić czas analizy do sensownych rozmiarów (od kilkunastu minut do paru godzin). Stałość przepływu i wysokie ciśnienie zapewnia specjalna pompa, a jako detektor najczęściej stosuje się spektrofotometr UV, który sprzężony z rejestratorem lub komputerowym urządzeniem rejestrującym wykreśla chromatogram, na podstawie którego można jakościowo (na podstawie czasów retencji, czyli czasu między rozpoczęciem analizy a opuszczeniem przez składnik kolumny chromatograficznej) i ilościowo (na podstawie wielkości pola pod analizowanym pikiem chromatogramu) określić konkretny składnik mieszaniny. Kolumny w HPLC to grubościenne rurki stalowe o średnicy wewnętrznej 2- mm i długości 10-30 cm. Przewody doprowadzające fazę ruchomą pod ciśnieniem też są wykonane z metalu i są grubościennymi kapilarami o średnicy wewnętrznej rzędu 0,1 mm
HPLC jest stosowana jako chromatografia podziałowa, adsorpcyjna, w układzie faz odwróconych, zarówno izokratycznie (taki sam skład fazy ruchomej przez cały proces) jak i gradientowo. Ten ostatni sposób polega na tym, że w czasie procesu faza ruchoma zmienia swój skład (w sposób kontrolowany), tak aby wszystkie składniki uległy rozdzieleniu a czas analizy nie był zbyt długi.
Cienkowarstwowa
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC), mimo wielu mankamentów, ze względu na taniość i prostotę jest wciąż bardzo popularna techniką jakościowej analizy mieszanin. Często wykorzystuje się ją do szybkiej analizy na obecność niepożądanych zanieczyszczeń. Przy jej zastosowaniu możliwa jest również analiza ilościowa, lecz tu znacznie przewyższa ją technika HPLC.
Rozwijanie chromatogramu odbywa się na płytkach szklanych lub z folii aluminiowej pokrytych cienką warstewką adsorbentu (stąd nazwa). Na suchą płytkę nanosimy na linię startową niewielką ilość rozdzielanej mieszaniny, nakrapiając kilka miniaturowych kropel roztworu mieszaniny i odparowując rozpuszczalnik. Następnie płytkę wstawiamy do naczynia z fazą ruchomą, tak by poziom fazy był około 1 cm poniżej linii startowej. Całość wstawiamy do komory chromatograficznej, naczynia szczelnie zamkniętego i nasyconego parami fazy ruchomej, aby w czasie procesu chromatograficznego, jako skutek parowania poszczególnych składników, nie zmieniał się skład fazy ruchomej.
Faza ruchoma, dzięki siłom kapilarnym, samorzutnie pełznie po płytce do góry, co nazywamy rozwijaniem chromatogramu. Zakończenie procesu następuje zazwyczaj po osiągnięciu przez czoło rozpuszczalnika wysokości 10 - 15 cm od linii startowej (wartość parametru d). Mierząc na płytce wartości a i b obliczamy dla poszczególnych substancji wartości tzw. współczynnika retencji Rf = droga substancji / droga czoła fazy ( Rf =a/d dla substancji niebieskiej i Rf = b/d dla substancji fioletowej - patrz rysunek poniżej). Współczynnik ten jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach procesu chromatograficznego i może służyć do wstępnej identyfikacji substancji.
Jeżeli rozdzielane substancje nie są barwne, plamy możemy obserwować w świetle ultrafioletowym (wykorzystujemy tu zjawisko fluorescencji) lub spryskujemy płytkę odpowiednim odczynnikiem, z którym składniki rozdzielanej mieszaniny dają barwne produkty reakcji. Prostym i dość skutecznym sposobem uwidaczniania bezbarwnych plam jest wstawienie płytki z rozwiniętym chromatogramem na parę minut do komory zawierającej pary jodu. W celu otrzymania par jodu wystarczy nasypać na dno komory parę kryształków pierwiastkowego jodu i poczekać kilka minut (sublimacja jodu).
Chromatografia jonowymienna to rodzaj cieczowej chromatografii kolumnowej. Jest to metoda preparatywna używana do wydzielenia z mieszaniny żądanej substancji.
W tej metodzie chromatografii faza stacjonarna, złoże, jest obdarzona ładunkiem. Stanowi je zazwyczaj żywica jonowymienna, zawierająca obdarzone ładunkiem grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik:
· pozytywnie naładowany jonowymieniacz (anionit) wiąże aniony
· negatywie naładowany jonowymieniacz (kationit) wiąże kationy.
Związki związane z jonowymieniaczem mogą być wymyte z kolumny przez stopniową elucję, a także poprzez zmianę stężenia soli lub pH.
Tego rodzaju chromatografii używa się do oddzielania takich związków jak aminokwasy, peptydy i białka. Chromatografia jonowymienna jest powszechnie stosowana do oczyszczania białek w systemie FPLC.
...
nauka877