Ćwiczenie 1: Hodowla drobnoustrojów
Wirusy – żywe komórki eukariotyczne
Bakterie – podłoża hodowlane naturalne lub sztuczne, sporadycznie żywe komórki
Grzyby – podłoże hodowlane naturalne lub sztuczne
I. Hodowla bakterii
Autotrofy (samożywne) Heterotrofy (cudzożywne)
- Fotoautotrofy - Prototrofy (jeden związek organiczny)
- Chemoautotrofy - Auksotrofy (więcej niż jeden związek)
Hodowla bakteryjna:
- statyczna (morfologia, fizjologia i biochemia bakterii)
- ciągła ( przemysł fermentacyjny, biologiczna produkcja związków chemicznych, technologia ścieków)
A. Warunki odżywcze (co może lub musi znajdować się w podłożach)
1. Woda (50-90%)
2. Sole mineralne: kationy: Na, K, NH4, Cu.
Aniony: Cl, CO3, SO4, PO4.
Pierwiastki śladowe: Zn, Mo, Co, Va oraz siarka i fosfor
Halofity – 1-15% NaCl.
3. Węglowodany – jedno- dwucukry, wielocukry, alkohole
4. Tłuszcze – niekiedy sól sodowa kwasu olejowego nie są konieczne, bakterie mogą je same syntetyzować.
5. Aminokwasy, związki amonowe, azotany – źródło azotu
6. Witaminy – większość poznanych
7. Czynniki wzrostowe – np. hematyna, kwas paraaminobenzoesowy
8. pH 7.0-7.4 (8.2) granice 4.0-8.0
B. Zapotrzebowanie na tlen
1. Bezwzględne tlenowce
2. Względne tlenowce
3. Mikroaerofile – nie rosną w atmosferze 21% tlenu a niższym stężeniu z dodatkiem CO2 np. 5% O2 + 10% CO2.
4. Bakterie beztlenowe
C. Temperatura
1. Psychofile 0-20oC 2. Mezofile 20-45oC 3. Termofile 30-90oC(50-70oC)
D. Podłoża bakteriologiczne
1. Naturalne
2. Sztuczne:
proste wzbogacone
płynne lub stałe cechy podłóż
namnażające odpowiednia wartość odżywcza
różnicujące optymalny odczyn pH
wybiórcze muszą być izotoniczne
specjalne przejrzyste
transportowe sterylne
II. Hodowla wirusów
1. Hodowle komórkowe (tkankowe)
2. Zarodki ptasie
3. Zwierzęta laboratoryjne
III. Hodowle grzybów
1. Mikrohodowle
2. Makrohodowle: płynne
stałe (Sabouranda, Czapka, agar z brzeczką)
3. Podłoża specjalne (auksonogram, zymogram)
4. Różnicujące (surowica, agar Grodkowa, z arbutyną)
Przygotowanie pożywek
1. Przygotowanie szkła: mycie, sterylizacja, przechowywanie
2. Przygotowywanie pożywek: odważki, rozpuszczenie, sterylizacja, przechowywanie.
3. Przygotowanie podłóż bakteriologicznych gotowych do użycia: pomieszczenie, podgrzewanie, rozlewanie, studzenie, przechowywanie.
Uzyskiwanie czystych kultur bakteryjnych
IDENTYFIKACJA – określenie badanej, czystej kultury jako gatunku na podstawie oznaczenia cech hodowlanych, morfologicznych, fizjologicznych, biochemicznych, serologicznych oraz genetycznych.
HODOWLA MIESZANA – pożywka wraz z wyrosłymi w niej lub na niej różnymi gatunkami drobnoustrojów
HODOWLA CZYSTA – pożywka wraz z wyrosłym na niej lub w niej tylko jednym rodzajem drobnoustroju.
KOLONIA –
A. Metody bezpośrednie:
1. Z użyciem mikromanipulatora (Caillone, V de Bruna, Emersona)
2. Metoda kropelkowa Lindnera.
B. Metody pośrednie:
1. Rozsiew powierzchniowy Kocha (metoda redukcyjna)
2. Rozmaz powierzchniowy (płytka mazana)
3. Posiew wgłębny (płytka lana)
4. Metoda seryjnych rozcieńczeń Litera
C. Metody pomocnicze:
1. Selekcyjne działanie temperatury
2. Selekcyjne działanie antybiotyków
3. Poprzez odpowiednio dobraną pożywkę (np. ruch U-rurka).
Faza rozmnażania się bakterii:
- zastoju
- logarytmicznego wzrostu
- zwolnionego wzrostu
- równowagi
- zamierania
- logarytmicznego zamierania
Pomiar wzrostu bakterii:
- określenie masy na jednostkę objętości
- test turbidymetryczny (rozproszenie światła proporcjonalnie do liczby bakterii)
- licznie pod mikroskopem (kamera Petroffa-Hausera)
- liczenie elektroniczne (licznik Coultera)
Oznaczanie liczby drobnoustrojów:
- bezpośrednie liczenie bakterii w preparacie
- oznaczenie liczby komórek w hemocytometrze (Thoma, Burkera)
- metoda filtrów membranowych
B. Metody pośrednie
- liczenie kolonii (rozmaz powierzniowy, płytka lana)
- nefelometryczna – chemiczna (skala Mc Farlanda – 1% chlorek baru + 1% kwas siarkowy)
- nefelometryczna spektrofotometryczna
- spektrofotometr (długośćfali 660 nm)
- densytometryczna
teresawawa