biochemia 1 - sprawozdanie D.pdf
(
89 KB
)
Pobierz
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 1 z 3
Data zajęć: 2008/06/05
Sprawozdanie 11.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Ćwiczenie D
Oznaczanie mostków disiarczkowych w białkach
Wstęp
Mostki disiarczkowe to wiązanie kowalencyjne dwóch atomów siarki (–S–S–), pochodzących
z grup tiolowych (–SH) z reszt cysteiny. Połączone dwie cysteiny tworzą cystynę. Jest
to ważna cząsteczka, ponieważ bierze udział w stabilizacji trzeciorzędowej struktury białek.
O
O
O
O
H
O
OH
H
O
OH
+
SH
H
S
S
S
NH
2
NH
2
NH
2
NH
2
cysteina
cysteina
cystyna
(reakcja 1.)
Celem ćwiczenia jest oznaczenie liczby mostków disiarczkowych w próbce poprzez
ich redukcję do wolnych grup SH, a następnie oznaczenie wolnych grup SH.
Do redukcji użyto borowodorku sodu (NaBH
4
). Rozpuszcza się w wodzie ulegając rozkładowi:
NaBH
4
+ 2H
2
O
NaBO
2
+ 4H
2
(reakcja 2.)
W celu oznaczenia grup SH użyto odczynnika Ellmanna, czyli DTNB (kwas 5,5’-ditiobis-2-
nitrobenzoesowy). Reaguje on stechiometrycznie, na jeden mol SH powstaje jeden mol
anionu TNB, zgodnie z równaniem reakcji:
NO
2
NO
2
NO
2
NO
2
HOOC
COOH
COOH
HOOC
+
+
R
SH
S
S
R
S
S
S
tiol alifatyczny
DTNB
TNB
(reakcja 3.)
Powstający anion TNB posiada barwę żółtą i maksymalną absorbancję przy fali długości 412 nm.
Prawo Lamberta-Beera
· ·
(1)
gdzie:
wartość absorbancji roztworu,
13600 M
cm
molowy współczynnik absorpcji TNB dla
412 nm
,
1 cm
grubość kuwety, czyli długość drogi optycznej,
stężenie TNB, prawo to działa dla roztworów rozcieńczonych.
Materiały
a)
Odczynniki:
Roztwór disiarczku – badany roztwór,
125 mg NaBH
4
– po rozpuszczeniu w wodzie, czynnik redukujący,
0,1 M bufor fosforanowy z 2 mM EDTA o pH 8,0,
1 M KH
2
PO
4
w 0,2 N HCl,
0,01 M DTNB – odczynnik Ellmanna,
propanon,
azot (N
2
).
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 2 z 3
Data zajęć: 2008/06/05
Sprawozdanie 11.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Ćwiczenie D
Oznaczanie mostków disiarczkowych w białkach
b)
Szkło laboratoryjne:
Probówki chemiczne,
Probówki kalibrowane 10 ml z korkiem szlifowanym,
Pipety automatyczna z regulacją: 200 μl – 1000 μl,
Pipeta pasteurowska (1 szt.),
Kuwety szklane (2 szt.).
c)
Aparatura:
Spektrofotometr „Specol”,
mikrowytrząsarka,
statywy do probówek (1 szt.),
łaźnia wodna o temperaturze 37°C,
bibuła, tryskawka.
Wykonanie
Ćwiczenie przeprowadzono zasadniczo zgodnie z treścią instrukcji „D”. Zrezygnowano
z dodawania oktanolu, ponieważ roztwór nie pienił się specjalnie mocno. Przygotowano dwie
próbki do oznaczenia liczby mostków disiarczkowych zamiast jednej.
1.
Przygotowano dwie kuwety.
2.
Do pierwszej kuwety (odnośnik) dodano 2 ml buforu fosforanowego.
3.
Do drugiej kuwety dodano 1 ml buforu fosforanowego i 1 ml roztworu disiarczku (badanego).
4.
Kuwety umieszczono w spektrofotometrze.
5.
Dodano do obu kuwet po 0,1 ml 0,01 M roztworu DTNB.
6.
Odczekano 5 minut.
7.
Wyzerowano względem odnośnika przy fali długości 412 nm.
8.
Odczytano absorbancję badanego roztworu,
.
9.
Umyto i wysuszono obie kuwety.
10.
Przygotowano trzy próbki kalibrowane z korkami.
11.
Do dwóch probówek dodano po 1 ml roztworu disiarczku.
12.
Do jeden probówki (odnośnik) dodano 1 ml buforu fosforanowego.
13.
Przygotowano 2,5% roztwór NaBH
4
, przez dodanie 5 ml wody do 125 mg NaBH
4
. Wymieszano.
14.
Do każdej probówki dodano po 1 ml roztworu NaBH
4
i uzupełniono wodą do 3 ml.
15.
Probówki inkubowano w łaźni wodnej 37°C przez 30 minut. Często mieszano zawartość probówek.
16.
Do każdej probówki dodano po 0,5 ml roztworu 1 M KH
2
PO
4
.
17.
Odczekano 5 minut. Do każdej probówki dodano po 2 ml propanonu. Wymieszano.
18.
Przez każdą próbkę przepuszczano azot przez 5 minut.
19.
Następnie do każdej dodano po 0,5 ml 0,01 DTNB i uzupełniono buforem do 6 ml.
20.
Każdą probówkę przykryto korkiem, tak aby nad roztworem pozostała warstwa azotu.
21.
Po 15 minutach odczytano wartości absorbancji,
, przy fali długości 412 nm dwóch
i
próbek wobec odnośnika.
Politechnika Wrocławska
Wydział Chemiczny
Strona 3 z 3
Data zajęć: 2008/06/05
Sprawozdanie 11.
Biochemia 1 (BTC3009l)
laboratorium
dr inż. Beata Greb-Markiewicz
Łukasz Czok
Mateusz Jędrzejewski
Grupa: IV
Ćwiczenie D
Oznaczanie mostków disiarczkowych w białkach
Wyniki
Ze wzoru (1)
·
· ·
1.
Oznaczenie liczby wolnych grup SH przed redukcją
0,005
Zmierzono:
Stężenie SH w kuwecie:
kuweta
A
0,005
13600
M
cm
· 1
cm
3,676 · 10
mol
c
przed
dm
ε · l
Stężenie SH w badanej próbce:
c
przed
2,1 · c
przed
kuweta
2,1 · 3,676 · 10
mol
dm
7,720 · 10
mol
dm
2.
Oznaczenie liczby wolnych grup SH po redukcji
0,215
Zmierzono:
0,230
0,215
0,230
2
0,2225
2
Stężenie SH w kuwecie:
kuweta
0,2225
13600
M
cm
· 1
cm
1,636 · 10
mol
c
po
dm
ε · l
Stężenie SH w badanej próbce:
c
po
6 · c
po
kuweta
6 · 1,636 · 10
mol
dm
9,816 · 10
mol
dm
3.
Obliczenie liczby mostków disiarczkowych
Stężenie mostków S–S, czyli disiarczku, jest równe połowie stężenia niedostępnych grup SH.
Natomiast stężenie niedostępnych grup SH to różnica stężenia wszystkich grup SH
(po redukcji) i stężenia dostępnych grup SH (przed redukcją).
9,816 · 10
mol
dm
7,720 · 10
mol
c
S
S
c
po
c
przed
dm
4,87 · 10
mol
dm
2
2
Wnioski
Stężenie mostków disiarczkowych w badanej próbce wynosi
4,87 · 10
mol
dm
. To oznacza,
że w
1 ml
roztworu jest prawie
3 · 10
mostków disiarczkowych (ponieważ
4,87 · 10
mol
dm
·
1 ml ·
2,93 · 10
). Gdzie
to liczba Avogadra równa
6,022 · 10
mol
.
Stężenie grup SH przed redukcją (
3,676 · 10
mol
dm
) jest niskie w porównaniu ze stężeniem po
redukcji (
9,816 · 10
mol
dm
). To oznacza, że badana próbka nie ma praktycznie wolnych grup SH.
Plik z chomika:
biotech_pwr
Inne pliki z tego folderu:
biochemia 1 - sprawozdanie A.pdf
(137 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie B.pdf
(123 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie D.pdf
(89 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie E.pdf
(105 KB)
biochemia 1 - sprawozdanie G.pdf
(103 KB)
Inne foldery tego chomika:
Biochemia - sprawozdania inne
E (moje)
H (moje)
Instrukcje
O (moje)
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin