biochemia 1 - sprawozdanie O.pdf - Biochemia - sprawozdania - biotech_pwr

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 1 z 3

Data zajęć: 2008/05/21

Sprawozdanie 9.

Biochemia 1 (BTC3009l)

laboratorium

dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Łukasz Czok

Mateusz Jędrzejewski

Grupa: IV

Ćwiczenie O

Elektroforetyczny rozkład białek

Wstęp

Elektroforeza to dyfuzja fazy rozproszonej względem ośrodka dyspersyjnego pod wpływem

przyłożonego z zewnątrz pola elektrycznego. Następuje rozdział cząsteczek obdarzonych

ładunkiem. Szybkość przemieszczania się zależy od własności takich jak: wielkość cząsteczki,

ładunek, zdolność do wiązania wody i jonów. Szybkość jest także wprost proporcjonalna

do przyłożonego napięcia. Miarą szybkości poruszania się jest szybkość w jednostkowym polu

elektrycznym zwana ruchliwością elektroforetyczną (R f ). Ruchliwość elektroforetyczna

danego rozdzielanego składnika jest stała podczas elektroforezy dla stałych warunków

eksperymentu takich jak: natężenie i napięcie prądu, pH, temperatura oraz siła jonowa.

Ruchliwość elektroforetyczna jest wprost proporcjonalny do ładunku elektrycznego

cząsteczki i odwrotnie proporcjonalny do jej wielkości. Zależy także od kształtu cząsteczki.

Ruchliwość elektroforetyczna

(1)

gdzie:

droga przebyta przez i-ty składnik (prążek),

droga przebyta przez wskaźnik.

Elektroforeza jako technika analityczna ma wiele odmian. Ze względu na rodzaj ośrodka

dyspersyjnego wyróżniamy: elektroforezę bibułową, kapilarną i żelową. Elektroforeza

kapilarna zwana jest też elektroforezą w wolnym buforze. Elektrolit swobodnie przemiesza

się w aparacie o kształcie U-rurki. Ten rodzaj elektroforezy służy najczęściej do rozdziału

niewielkich cząsteczek.

W elektroforezie żelowej ośrodkiem w którym przemieszczają się badane substancje jest żel.

Najczęściej spotykanym jest żel poliakrylamidowy. Spełnia ona wszystkie cech idealnego

nośnika. Jest uformowany najczęściej na płytce długości kilkunastu centymetrów. Równie

dobrze może być w kształcie okrągłej rurki. Nanosi się próbkę na żel, a do końców żelu

przykłada się stałe napięcie. Otrzymany żel po rozdziale wybarwia się. Rozdzielone frakcje

są widoczne w postaci pasków (prążków). Ten rodzaj elektroforezy jest kombinacją wędrówki

w polu elektrycznym oraz sądzenia molekularnego. Jest najczęściej stosowany do rozdzielania

DNA, RNA lub białek. W elektroforezie można badać ładunek czy wielkość poruszających się

cząsteczek, ale także jednorodność wyizolowanych makrocząsteczek.

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie rozdziału elektroforetycznego w żelu poliakrylamidowym

białka albuminy oraz kwaśnej fosfatazy.

Materiały

a) Odczynniki:

0,065 M TRIS – kwas borowy (H 3 BO 3 ) – bufor do elektroforezy o pH 9,0,

0,1% roztwór wodny błękitu bromofenolowego – wskaźnik,

50% roztwór sacharozy zabarwionej wskaźnikiem,

rurki z żelem poliakrylamidowym,

roztwór do barwienia żeli,

roztwór do odbarwiania żeli,

roztwór albuminy i fosfatazy kwaśnej – próbki do badań.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 2 z 3

Data zajęć: 2008/05/21

Sprawozdanie 9.

Biochemia 1 (BTC3009l)

laboratorium

dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Łukasz Czok

Mateusz Jędrzejewski

Grupa: IV

Ćwiczenie O

Elektroforetyczny rozkład białek

b) Szkło laboratoryjne:

probówki małe (2 szt.),

probówki z korkiem (2 szt.),

bagietka,

szkiełko mikroskopowe podstawowe,

pipeta pasteurowska.

c) Aparatura:

aparat do elektroforezy z pełnym wyposażeniem,

łaźnia wodna o temperaturze 55°C.

Wykonanie

Część I Nanoszenie próbek na żel

1. Przygotowano dwie małe probówki.

2. Do każdej z nich dodano po 100 μl sacharozy z barwnikiem.

3. Do pierwszej probówki dodano 100 μl albuminy. Wymieszano.

4. Do drugiej probówki dodano 100 μl kwaśnej fosfatazy. Wymieszano.

5. Zgodnie z instrukcją „O” przygotowano aparat do elektroforezy.

6. Na górę żelu z pierwszej rurki naniesiono 100 μl zawartości probówki pierwszej.

7. Na górę żelu z drugiej rurki naniesiono 100 μl zawartości probówki drugiej.

Część II Rozdział elektroforetyczny

1. Zamknięto górną pokrywą aparat do elektroforezy.

2. Podłączono przewodami do zasilacza i włączono przepływ prądu.

3. Ustawiono natężenie prądu na 3 mA na jeden żel.

4. Odczekano aż wskaźnik przejdzie z żelu zagęszczającego do żelu rozdzielającego w rurce.

5. Ustawiono natężenie prądu na 5 mA na jeden żel.

6. Gdy wskaźnik osiągnął dół żelu wyłączono zasilanie.

Część III Wybarwienie i odbarwianie żelu

1. Wykręcono obie rurki z aparatu do elektroforezy.

2. Żel z każdej rurki wypchnięto bagietką na szkiełko mikroskopowe podstawowe.

3. Odcięto żel zagęszczający oraz część żelu rozdzielającego poniżej wskaźnika.

4. Środkowe części żeli przełożono do odpowiednich probówek z korkami, wskaźnikiem do dołu.

5. Dodano odczynnika zabarwiającego, tyle żeby każdy żelu był całkowicie zalany.

6. Probówki umieszczono w łaźni wodnej 55°C na 15 minut.

7. Odlano barwnik do specjalnego pojemnika.

8. Do żeli w probówkach dodano odczynnika odbarwiającego.

9. Inkubowano w łaźni wodnej 55°C przez 15 minut.

10. Mieszano zawartość probówek.

11. Odlano roztwór.

12. Czynności z pkt. 8, 9, 10,11 powtarzano aż cały żel (poza białkami) odbarwi się.

13. Naszkicowano położenie prążków rysunek 1. oraz rysunek 2.

14. Zmierzono położenie powstałych prążków.

Uwagi

Wybarwianie powtórzono 5-krotnie.

Nie przygotowywano żeli ani nie wypełniano rurek żelem. Skorzystano z już przygotowanych.

Politechnika Wrocławska

Wydział Chemiczny

Strona 3 z 3

Data zajęć: 2008/05/21

Sprawozdanie 9.

Biochemia 1 (BTC3009l)

laboratorium

dr inż. Beata Greb-Markiewicz

Łukasz Czok

Mateusz Jędrzejewski

Grupa: IV

Ćwiczenie O

Elektroforetyczny rozkład białek

Wyniki

Po elektroforezie, wybarwieniu i odbarwianiu otrzymano obrazy* prążków na żelu**.

Rysunek. 1. – żel z prążkami

albuminy

Rysunek. 2. – żel z prążkami

kwaśnej fosfatazy

* zachowano skalę 1:1, kierunek dyfuzji białek przebiega z góry na dół,

** z góry odcięto żel zagęszczający, z dołu żel rozdzielający poniżej linii wskaźnika.

Zmierzono położenie prążków w żelu i wyznaczono ruchliwości elektroforetyczne ze wzoru (1).

Dla albuminy (rysunek 1.)

43 mm

25 mm

33 mm

Dla kwaśnej fosfatazy (rysunek 2.)

47 mm

20 mm

25 mm

28 mm

25 mm

43 mm 0,58

20 mm

47 mm 0,43

33 mm

43 mm 0,77

25 mm

47 mm 0,53

28 mm

47 mm 0,60

Wnioski

Rozdział białek nastąpił ponieważ składają się one z różnych domen, które wykazują różną

ruchliwość elektroforetyczną.

Albumina w elektroforezie dała dwa prążki. Można domniemywać, że składa się z dwóch

heterogenicznych domen. Kwaśna fosfataza w elektroforezie dała trzy prążki. Można

domniemywać, że jest trimerem.

Nie można jednoznacznie zidentyfikować kolejnych domen, ponieważ nie przeprowadzono

elektroforezy porównawczej dla wzorca mas białek. W związku z tym położenie prążka

na żelu nie można przeliczyć na masę danej domeny w Daltonach.

Nie można też jednoznacznie przesądzić o jednorodności badanych preparatów. W tym celu

należałoby przeprowadzić elektroforezę w różnych warunkach, stosując bufory różniące się

pH i siłą jonową.

biochemia 1 - sprawozdanie O.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: