9_Izolacja_i_charakterystyka_tluszczowcow.pdf

IZOLACJA I CHARAKTERYSTYKA

TŁUSZCZOWCÓW

EKSTRAKCJA LIPIDÓW Z MATERIAŁU BIOLOGICZNEGO

Zasada:

Lipidy nie rozpuszczaj ą si ę w wodzie, lecz w rozpuszczalnikach organicznych,

np. benzynie, chloroformie, eterze, alkoholu, acetonie i innych, cho ć w ró Ŝ nym

stopniu, zale Ŝ nie od warunków. Wła ś ciwo ś ci te stanowi ą podstaw ę metod eks-

trakcji i frakcjonowania lipidów z ka Ŝ dego materiału biologicznego, zarówno

o strukturze komórkowej, tkankowej, jak i z macierzy pozakomórkowej, w tym

z surowicy krwi. Rozdzielanie tłuszczów prostych od tłuszczów zło Ŝ onych

opiera si ę na ich odmiennej rozpuszczalno ś ci w zimnym acetonie. Tłuszcze pro-

ste oraz pochodne lipidowe (estry steroli i kwasów tłuszczowych) rozpuszczaj ą

si ę w zimnym acetonie, natomiast tłuszcze zło Ŝ one (lecytyny, kefaliny, sfingo-

mieliny i glikolipidy) s ą nierozpuszczalne. Lipidy obecne w surowicy krwi s ą

składnikami lipoprotein, które s ą rozpuszczalnymi w wodzie kompleksami biał-

kowo-lipidowymi. W ekstrakcie lipidowym surowicy stwierdza si ę obecno ść

triacylogliceroli, fosfolipidów, cholesterolu wolnego i zestryfikowanego oraz

wolnych kwasów tłuszczowych. Dogodnym ź ródłem otrzymywania lecytyny s ą

komórki jajowe bogato Ŝ ółtkowe, poniewa Ŝ obecne w nich złogi deutoplazma-

tyczne zawieraj ą wiele tłuszczowców, w ś ród których lecytyna stanowi znacz ą c ą

cz ęść . Ekstrakcj ę lecytyny przeprowadza si ę przy u Ŝ yciu rozpuszczalników

organicznych.

1. Ekstrakcja lipidów z surowicy krwi

Wykonanie:

Do probówki wirówkowej odmierzy ć 0,5 ml surowicy, doda ć 10 ml mieszani-

ny chloroform – metanol (w stosunku 2:1), probówk ę zamkn ąć korkiem

i wstawi ć na 30 minut do wytrz ą sarki.

Nast ę pnie doda ć 2 ml 0,1 M roztworu NaCl i dalej wytrz ą sa ć przez 10 minut.

Po tym czasie próby wirowa ć przy 3000 obr./min przez 10 minut.

Po odwirowaniu warstw ę górn ą , wodno-alkoholow ą , odpipetowa ć i odrzuci ć ,

natomiast warstw ę doln ą , chloroformow ą , zachowa ć , poniewa Ŝ jest lipido-

wym ekstraktem surowicy.

Ekstrakt lipidów surowicy przeznaczony jest do rozdziału metod ą chromato-

grafii cienkowarstwowej na Ŝ elu krzemionkowym na poszczególne frakcje li-

pidów lub do analiz jako ś ciowych.

2. Ekstrakcja lecytyny z Ŝ ółtka jaja kurzego

Wykonanie:

W mo ź dzierzu porcelanowym umie ś ci ć 3 g suchego, sproszkowanego Ŝ ółtka

(lub ś wie Ŝ ego), zala ć 10 ml mieszaniny chloroform – metanol (w stosunku

2:1) i rozciera ć przez 5 minut.

· Nast ę pnie ekstrakt przes ą czy ć przez s ą czek zwil Ŝ ony mieszanin ą ekstrakcyj-

n ą . Przes ą cz odparowa ć do sucha we wrz ą cej ła ź ni wodnej, pod dygestorium.

Pozostała oleista, pomara ń czowobrunatna masa po ostudzeniu przyjmuje kon-

systencj ę wazeliny i stanowi surowy ekstrakt lecytyny. Otrzymany surowy

ekstrakt lecytyny jest zanieczyszczony ró Ŝ nymi zwi ą zkami, w tym barwni-

kami nale Ŝą cymi do karotenów. Ekstrakt przeznaczy ć do dalszych analiz ja-

ko ś ciowych.

CHARAKTERYSTYKA JAKO Ś CIOWA LIPIDÓW

W zale Ŝ no ś ci od rodzaju, ś wie Ŝ o ś ci i stopnia zanieczyszczenia tłuszcze maj ą

ró Ŝ ne warto ś ci liczb tłuszczowych, czyli: liczby kwasowej, liczby zmydlania

i liczby jodowej.

Liczba kwasowa jest to ilo ść KOH potrzebna do zoboj ę tnienia wolnych kwa-

sów tłuszczowych zawartych w 1 g tłuszczu. Jej warto ść jest miar ą zawarto ś ci

w tłuszczu wolnych kwasów tłuszczowych, powstałych wskutek rozerwania

cz ęś ci wi ą za ń estrowych, których ilo ść zale Ŝ y od warunków i czasu przecho-

wywania tłuszczu oraz obecnych zanieczyszcze ń . Tłuszcze nie ś wie Ŝ e lub zafał-

szowane wolnymi kwasami tłuszczowymi posiadaj ą wysokie liczby kwasowe.

Liczba zmydlania jest to ilo ść miligramów KOH, potrzebna do zmydlenia

(zhydrolizowania) 1 g tłuszczu i zoboj ę tnienia zawartych w nim wolnych kwa-

sów tłuszczowych. Jej warto ść jest odwrotnie proporcjonalna do ś redniej masy

cz ą steczkowej (a tym samym do długo ś ci ła ń cucha w ę glowodorowego) kwa-

sów tłuszczowych wchodz ą cych w skład danego tłuszczu. Wysok ą warto ść

liczby zmydlania posiadaj ą tłuszcze zawieraj ą ce stosunkowo du Ŝą ilo ść kwasów

o krótkich ła ń cuchach, takich jak np. kwas masłowy, kapronowy i kaprylowy.

Nisk ą warto ść liczby zmydlania maj ą tłuszcze charakteryzuj ą ce si ę du Ŝą zawar-

to ś ci ą kwasów tłuszczowych o długich ła ń cuchach w ę glowodorowych.

Liczba jodowa jest to ilo ść gramów jodu, któr ą mog ą przył ą czy ć nienasycone

kwasy tłuszczowe zawarte w 100 g danego tłuszczu. Jej warto ść jest miar ą za-

warto ś ci w tłuszczu nienasyconych kwasów tłuszczowych. Wysok ą liczb ą jo-

dow ą charakteryzuj ą si ę tłuszcze bogate w nienasycone kwasy tłuszczowe, np.

oleje ro ś linne lub tran, natomiast nisk ą charakteryzuj ą si ę tłuszcze ubogie

w nienasycone kwasy tłuszczowe, np. triacyloglicerole zwierz ę ce. Liczba jodo-

wa słu Ŝ y do charakterystyki ró Ŝ nego pochodzenia tłuszczów (ro ś linnych, w ą -

troby niektórych ryb, zwierz ę cych).

3. Oznaczanie liczby kwasowej tłuszczów

Zasada:

Rozpuszczony tłuszcz miareczkuje si ę 0,1 M roztworem KOH w obecno ś ci fe-

noloftaleiny do trwałego ró Ŝ owego zabarwienia. Tak samo post ę puje si ę z prób ą

ś lep ą , któr ą jest sam rozpuszczalnik. Liczba moli zu Ŝ ytego roztworu wodoro-

tlenku potasu zu Ŝ yta do miareczkowania równa jest liczbie moli wolnych kwa-

sów tłuszczowych w analizowanej próbie.

OBLICZANIE WYNIKÓW:

liczba kwasowa = 5,611

(x-y)/c

gdzie:

x – ilo ść ml 0,1 M KOH zu Ŝ yta na miareczkowanie próby badanego tłuszczu

y – ilo ść ml 0,1 M KOH zu Ŝ yta na miareczkowanie próby ś lepej

c – ilo ść gramów tłuszczu

Wykonanie:

Przygotowa ć trzy kolby sto Ŝ kowe o pojemno ś ci 100 ml, do których nale Ŝ y

wprowadzi ć :

– 5 g tłuszczu I i 30 ml alkoholu etylowego – do pierwszej kolby,

– 5 g tłuszczu II i 30 ml alkoholu etylowego – do drugiej kolby,

– 30 ml alkoholu etylowego (próba ś lepa) – do trzeciej kolby.

Wszystkie kolby lekko podgrza ć , do rozpuszczenia tłuszczu .

Po schłodzeniu, ka Ŝ d ą prób ę :

miareczkowa ć 0,1 M roztworem KOH w obecno ś ci fenoloftaleiny. Obliczy ć

warto ś ci liczb kwasowych dla obu prób tłuszczów, porówna ć i zinterpretowa ć

uzyskane wyniki, wskazuj ą c, który z oznaczanych tłuszczów jest nie ś wie Ŝ y.

4. Zmydlanie tłuszczów, odczyn na obecno ść kwasów

tłuszczowych

Zasada:

Reakcja zmydlania, czyli hydrolizy tłuszczów – zarówno prostych, jak i fosfoli-

pidów – zachodzi łatwo w ś rodowisku zasadowym. Produktami reakcji, poza

alkoholem, s ą mydła, czyli sole wy Ŝ szych kwasów tłuszczowych.

H 2 C

O C R

H 2 C

H 2 C OH

KOH

3 R COOK

O C R

triacyloglicerol

glicerol

mydła potasowe

Mydła potasowe i sodowe s ą rozpuszczalne w wodzie. Jako sole słabych kwa-

sów oraz mocnych zasad wykazuj ą odczyn zasadowy. Mydła rozpuszczalne

w wodzie s ą substancjami powierzchniowo czynnymi, czyli detergentami. Na-

tomiast mydła wapniowe lub magnezowe s ą nierozpuszczalne w wodzie i wy-

tr ą caj ą si ę z roztworu.

Wykonanie:

Przygotowa ć such ą próbówk ę , do której wprowadzi ć :

– 5 kropli oliwy lub innego tłuszczu wskazanego przez asystenta,

– 5 ml 10% alkoholowego roztworu KOH.

Ogrzewa ć we wrz ą cej ła ź ni wodnej do otrzymania około 2 ml opalizuj ą cego

roztworu, po odparowaniu alkoholu (po 10–15 min). Wstrz ą sn ąć probówk ą ,

pienienie si ę roztworu ś wiadczy o obecno ś ci w nim mydeł.

· Nast ę pnie otrzymany roztwór mydeł rozdzieli ć równo do dwóch probówek.

Do jednej probówki doda ć par ę kropli 1 M H 2 SO 4 , a Ŝ do uzyskania odczynu

kwa ś nego (sprawdzi ć wobec papierka wska ź nikowego). W tych warunkach

wytr ą caj ą si ę nierozpuszczalne w wodzie kwasy tłuszczowe.

Do drugiej probówki dodawa ć kroplami 1 M roztwór CaCl 2 , a Ŝ do pojawienia

si ę osadu nierozpuszczalnych w wodzie mydeł wapniowych.

5. Wykrywanie nienasyconych kwasów tłuszczowych

Zasada:

Reakcja addycji chlorowców do atomów w ę gla wi ą zania podwójnego stosowa-

na jest jako próba chemiczna na obecno ść wi ą za ń nienasyconych w zwi ą zkach

organicznych. Nienasycone kwasy tłuszczowe reaguj ą z chlorowcami (J 2 , Br 2 ,

Cl 2 ), które przył ą czaj ą si ę do wi ą za ń podwójnych. Reakcje te s ą podstaw ą ilo-

ś ciowego oznaczania nienasyconych wi ą za ń (oznaczanie liczby jodowej) oraz

podstaw ą metod rozró Ŝ niania mi ę dzy nasyconymi i nienasyconymi kwasami

tłuszczowymi. Wykrywanie wi ą za ń podwójnych metod ą Hübla opiera si ę na

tym, Ŝ e roztwór jodu ma brunatne zabarwienie, natomiast po addycji jodu do

wi ą za ń podwójnych (w obecno ś ci katalizatora reakcji HgCl 2 ) nast ę puje odbar-

wienie roztworu, gdy Ŝ jod cz ą steczkowy przechodzi w bezbarwny jon jodkowy,

zwi ą zany organicznie. W reakcji Hübla dochodzi do przył ą czenia dwóch ato-

mów jodu do ka Ŝ dego podwójnego wi ą zania w ła ń cuchu kwasu tłuszczowego.

H H

J 2

R (CH 2 ) 8 C C (CH 2 ) 7 C

J 2

H H

R (CH 2 ) 8 C C (CH 2 ) 7 C

J J

gdzie:

R – reszta ła ń cucha w ę glowodorowego kwasu tłuszczowego.

Podobna sytuacja zachodzi, gdy zamiast jodu wykorzystuje si ę wod ę bromow ą

o Ŝ ółtej barwie. Po addycji bromu pierwiastkowego do wi ą za ń podwójnych na-

st ę puje odbarwienie roztworu. Addycja tlenu do wi ą za ń podwójnych nienasy-

conych kwasów tłuszczowych sprawia, Ŝ e fioletowo zabarwiony roztwór nad-

manganianu potasu odbarwia si ę , przechodz ą c w roztwór br ą zowy z powodu

pojawienia si ę jonów Mn +4 .

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: