Chromatografia - Powinowactwa.pdf - CHROMATOGRAFIA - namida

8. Chromatografia powinowactwa ( a ffinity c hromatography - AC )

Chromatografia powinowactwa jest szczeglnym typem chromatografii adsorpcyjnej,

w ktrej wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwch substancji. Ze względu na swe

unikalne właściwości pozwala znacznie uprościć procedurę izolowania wybranej substancji,

przy jednoczesnym zachowaniu jej biologicznej aktywności.

8.1. Podstawy teoretyczne chromatografii powinowactwa

Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej z unieruchomionym ligandem

może mieć rżny charakter, może to być oddziaływanie pomiędzy:

- hormonem i receptorem,

- enzymem i substratem,

- enzymem i inhibitorem,

- przeciwciałem i antygenem lub haptenem,

- komplementarnymi odcinkami kwasw nukleinowych,

- kwasami nukleinowymi i białkami,

- lektynami i glikoproteinami,

- dopełniaczem i przeciwciałami z grupy IgG, itp.

Warto zwrcić uwagę na to, że w przypadku każdej pary oddziałujących cząsteczek, nie

ma znaczenia, ktra z nich zostanie wybrana jako ligand. Przykładowo, jeżeli dysponujemy

czystym antygenem możemy wyizolować monospecyficzne przeciwciała poliklonalne

z surowicy odpornościowej, ale działając odwrotnie, możemy wyodrębnić antygen po

przygotowaniu złoża, ktre zawiera unieruchomione odpowiednie przeciwciała.

Chromatografię powinowactwa przeprowadza się zwykle w dwch etapach.

W pierwszym etapie przez kolumnę przepuszcza się materiał zawierający molekuły

komplementarne do liganda. Przemieszczające się w obrębie złoża molekuły odnajdują

unieruchomiony ligand i wiążą się z nim. Po odmyciu nieswoiście zaadsorbowanych molekuł

rozpoczyna się drugi etap, w ktrym dochodzi do dysocjacji powstałych kompleksw i elucji

swoiście związanych makromolekuł. Dysocjacji kompleksw można dokonać w rżny

sposb. Można zastosować specyficzny eluent, zawierający kompetytor wspłzawodniczący

o miejsca wiążące z ligandem. Na przykład plazminogen związany z unieruchomioną lizyną

można odmyć kwasem

-aminokapronowym, ktry - podobnie jak lizyna - jest inhibitorem

plazminy, aktywnej formy plazminogenu. Zarwno kwas

-aminokapronowy jak i lizyna

wiążą się do tego samego miejsca w cząsteczce plazminogenu. Można jednak eluować

związane substancje w sposb niespecyficzny, za pomocą buforw o niskiej lub wysokiej

112

wartości pH (np. bufor octanowy, bufor węglanowy, itp.), roztworw o wysokiej sile jonowej

(2,5 M roztwr NaCl), czy związkw rozrywających wiązania wodorowe (4-8 M roztwr

mocznika, 6 M roztwr guanidyny). Po zakończeniu elucji należy usunąć zastosowane w tym

celu substancje od wyizolowanych makromolekuł. Można to zrobić rżnymi metodami, np.

stosując dializę, ultrafiltrację lub filtrację żelową.

Zalety i wady metody chromatografii powinowactwa

Zalety:

- brakograniczeń w stosunku do objętości nanoszonej na kolumnę prbki oraz do

stężenia separowanego materiału w prbce

- możliwość silnego zatężenia izolowanej molekuły

- bardzo wysoka specyficzność

- możliwość uzyskania w czystej postaci molekuł, ktre często nie mogą być

izolowane innymi metodami

- wyizolowanymateriał charakteryzuje się bardzo wysokim stopniem czystości

pomimo zastosowania tylko jednego kroku preparatywnego.

Wady:

- trudności z uzyskaniem niektrych specyficznych ligandw

- częsta konieczność przygotowania złoża we własnym zakresie

- niskatrwałość niektrych ligandw.

8.2. Złoża stosowane do chromatografii powinowactwa

Jako nośniki w chromatografii powinowactwa stosowane są złoża, ktre tradycyjnie

wykorzystuje się do filtracji żelowej, z tym, że przed użyciem wymagają one odpowiedniej

aktywacji. Są to pochodne dekstranowe ( Sephadex ), agarozowe ( Sepharose ) lub czasami

poliakrylamidowe. Do aktywacji żeli dekstranowych i agarozowych powszechnie stosuje się

reakcję z bromocyjanem. Oprcz nośnikw, ktre można przygotować do celu chromatografii

powinowactwa we własnym zakresie, dostępne są rwnież złoża przystosowane już do

chemicznego wiązania liganda, np. CNBr-Sepharose 4B . Charakter wiązania między

ligandem i nośnikiem zależy zarwno od rodzaju substancji używanej jako ligand, jak i od

nośnika. Powstające podczas aktywacji żelu bromocyjanem ugrupowania karboimidowe

reagują wyłącznie z grupami aminowymi przyłączanej substancji. Z aktywnym nośnikiem

można związać chemicznie wszystkie typy biopolimerw zawierające grupy aminowe.

Ligandy białkowe można także związać za pomocą grup karboksylowych (Glu, Asp), reszt

hydroksylowych (Tyr, Ser, Thr) oraz reszt sulfhydrylowych (Cys). Kwasy nukleinowe można

113

przyłączyć do nośnika za pośrednictwem reszt fosforanowych lub grup enolowych zasad

azotowych, a cukrowce przez grupy wodorotlenowe reszt cukrowych. Tabela 8.1. podaje

rodzaje nośnikw, reagujące z nimi grupy funkcyjne ligandw oraz ligandy mogące być

wiązane w ten sposb do nośnika.

Tabela 8.1.

Zestawienie najczęściej stosowanych złż przeznaczonych do samodzielnego wiązania

ligandw. Dane zaczerpnięto z aktualnego (2000 r.) katalogu firmy Amersham Pharmacia

Biotech.

Ligand ktry może być związany z

nośnikiem

Grupa funkcyjna liganda przeznaczona

do wiązania z nośnikiem

Nazwa złoża (nośnika)

Białka, peptydy, aminokwasy, kwasy

nukleinowe i polinukleotydy

aminowa

CNBr-activated Sepharose 4B

CNBr-activated Sepharose 4B Fast Flow

Activated CH-Sepharose 4B

NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow

Epoxy-activated Sepharose 6B

CH-Sepharose 4B

Białka, peptydy, aminokwasy

karboksylowa

AH-Sepharose 4B

Cukry

hydroksylowa

Epoxy-activated-Sepharose 6B

Kwasy nukleinowe przez koniec 5Ó

aldehydowa

Agarose Adipic Acid Hydrazide

Białka, peptydy, aminokwasy

i nukleotydy zawierające siarkę

tiolowa

Thiopropyl-Sepharose 6B

Activated-Thiol-Sepharose 4B

Antybiotyki, hormony, koenzymy,

inne niskocząsteczkowe biomolekuły

grupy dystansowe:

aminowa, tiolowa hydroksylowa

karboksylowa,

aldehydowa

NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow

CH-Sepharose 4B

AH-Sepharose 4B

Epoxy-activated-Sepharose 6B

Activated-Thiol-Sepharose 4B

Thiopropyl-Sepharose 6B

Agarose Adipic Acid Hydrazide

Wprowadzenie grup dystansowych pozwala wydatnie zwiększyć możliwości wiązania

makromolekuł do niskocząsteczkowych ligandw. Eliminuje się w ten sposb efekty

steryczne reszt cukrowych nośnika podczas sorpcji makromolekuł. Jest to szczeglnie istotne

wwczas, gdy ligandem jest krtki peptyd, a substancja izolowana przy jego pomocy jest

znacznie większa i może mieć przysłonięte przestrzennie miejsce wiążące ligand. Można

w takich sytuacjach zastosować odpowiednio zmodyfikowane nośniki, np. AH i CH-

Sepharose czy NHS-ctivated Sepharose FF , ktre mają wbudowane kilkuwęglowe

(najczęściej 6-cio atomowe) łańcuchy alifatyczne. Za ich pośrednictwem dochodzi do

wiązania liganda z nośnikiem.

114

W wielu przypadkach ten sam ligand może być wykorzystany do izolowania rżniących

się makromolekuł. Przykładowo, po zastosowaniu złoża ze związanym białkiem A można

wyodrębnić większość immunoglobulin klasy G, a na złożu ze związanym polinukleotydem

(PolyU) można specyficznie izolować mRNA ale też RNA pochodzenia roślinnego. W tabeli

8.2. zestawione są aktualnie dostępne złoża przeznaczone do izolowania rżnych grup

biopolimerw.

Tabela 8.2.

Zestawienie specyficznych złż przeznaczonych do chromatografii powinowactwa. Dane

zaczerpnięto katalogw firmy Amersham Pharmacia Biotech (1999 r. i 2000 r.).

Specyficzność w stosunku do liganda

Nazwa handlowa złoża

Region F c immunoglobulin G,

umożliwia frakcjonowanie podklas IgG

Protein A Sepharose CL-4B

Protein A Sepharose 4 FF

rProtein A Sepharose FF

Protein G Sepharose 4B

Protein G Sepharose 4 FF

Protein G Sepharose CL-6B

STREAMLINE rProtein A

Przeciwciała IgM (hybridoma i ludzkie)

Przeciwciała IgY z żłtka jaja

HiTrap IgM purification column

HiTrap IgY purification column

-D-glukoza

strukturalnie podobne cząsteczki

Lentil Lectin Sepharose 4B

Con A Sepharose 4B

Agarose Wheat Germ Lectin

N-acetyl-D-glucosamina,

-2-makroglobulina, ceruloplazmina, polimer haptoglobina-

hemoglobina,

Wheat Germ Lectin Sepharose 6 MB

Eukariotyczny mRNA, dehydrogenazy zależne od NADP,

dehydrogenazy zależne od NAD,

7-Methyl-GTP Sepharose 4B

2Ó5ÓADP Sepharose 4B

5Ó AMP Sepharose 4B

Polimeraza DNA, polimeraza RNA

białka wiążące DNA

DNA(denaturated)-Agarose

DNA(native)-Agarose

poli(A) i poli(U) nukleotydy,

białka wiążące RNA, interferon

mRNA i rybosomy,

Oligo(dT)-cellulose

Poly(U) Sepharose 4B

Poly(A) Sepharose 4B

AGPOLY(I) . POLY(C)

AGPOLY(U)

Rybosomalny RNA, podwjna nić DNA, plazminogen, aktywator

plazminogenu,

Lysine Sepharose 4B

Szeroka klasa enzymw zależnych od nukleotydw, interferon,

albumina i inne białka

Blue Sepharose CL-6B

Blue Sepharose 6 FF

Red Sepharose CL-6B

115

-D-mannoza,

Endotoksyny

Lentil Lectin Sepharose 4B

Con A Sepharose 4B

Czynniki wzrostu, czynniki krzepnięcia, lipoproteiny, proteazy

Heparin Sepharose CL-6B

STREAMLINE Heparin

Białko A i białko G oraz ich koniugaty

IgG Sepharose 6 FF

Fibronektyna

Gelatin Sepharose 4B

Białka oddziałujące z kalmoduliną, neurotransmitery, kinazy

białkowe

Calmodulin Sepharose 4B

Białka zależne od glutationu, S-transferazy

Glutathione Sepharose 4B

Proteazy serynowe

Beznzamidine Sepharose 6B

Arginine Sepharose 4B

Biotynlowane substancje

Streptavidin Sepharose HP

Jony metali, molekuły wiążące jony metali

Chelating Sepharose FF

STREAMLINE Chelating

Warto zauważyć, że chromatografia powinowactwa może być z powodzeniem użyta

rwnież w celu eliminacji niepotrzebnych substancji z interesującego nas preparatu. Dla

przykładu, końcowym etapem izolowania fibrynogenu może być przepuszczenie izolatu przez

złoża Gelatin-Sepharose 4B i Lysine-Sepharose 4B , dzięki czemu otrzymany preparat

fibrynogenu będzie wolny od śladowych ilości fibronektyny i plazminogenu. W innych

sytuacjach dobrze jest zastosować dodatkowe oczyszczanie preparatw, tak aby pozbyć się

endotoksyn ( Lentil Lectin Sepharose 4B , Con A Sepharose 4B ) lub proteaz serynowych

( Benzamidine Sepharose 6B , Arginin Sepharose 4B ).

Szereg złż przedstawionych w tabeli 8.2. dostępnych jest w postaci gotowych

kolumienek typu HiTrap , ktre mogą być z powodzeniem instalowane zarwno w systemach

HPLC i FPLC jak i w systemach chromatografii niskociśnieniowej. Co więcej, przepływ

solwentw i prbek przez te kolumny może być wymuszany przy pomocy zwykłej

strzykawki. Dostępne w tej wersji są:

- HiTrap NHS-Activated

- HiTrap Protein A, HiTrap rProtein A

- HiTrap Protein G

- HiTrap Peanut Lectin, HiTrap Lentil Lectin, HiTrap Wheat Germ Lectin

- HiTrap Con A

- HiTrap Heparin

- HiTrap Chelating

- HiTrap Blue

- HiTrap IgM purification column

116

Chromatografia - Powinowactwa.pdf

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: