Biosensory.pdf

Jednym z postħpw w biotechnologii, pozwalajĢcy na pozyskiwanie

biologicznie aktywnych skþadnikw Ňywych organizmw oraz ich wiĢzanie

ze staþym noĻnikiem, pozwoliþ na opracowanie nowych metod, ktre mogĢ

zastħpowaę niektre fizykochemiczne metody. Do nich naleŇĢ metody

enzymatyczne i ich rozwiniħcie, tj. metody z zastosowaniem biosensorw.

Termin biosensor pojawiþ siħ w literaturze 1950 roku. Jednak to dopiero w

roku 1962, Clark i Lyons zbudowali pierwszy bioczujnik, w ktrym

jonoselektywna elektroda tlenowa zostaþa wyposaŇona w enzym jako

membranħ do detekcji glukozy.

Podstawowa definicja:

Biosensor- jest to czujnik, ktrego element biologiczny oddziaþuje z

substancjĢ oznaczanĢ, a efekt jest przeksztaþcany przez zespolony z nim

element niebiologiczny (transduktor) na sygnaþ elektryczny.

Czyli:

Bioczujniki (biosensory) to sensory chemiczne skþadajĢce siħ z dwch

zasadniczych elementw:

* warstwy receptorowej w postaci materiaþu biologicznego

Ğ przetwornika elektrycznego lub optycznego

Mamy tu : Schemat ideowy Biosensora

Oglne rŇnice w budowie biosensorw dotyczĢ elementu biologicznego

oraz transduktora.

N rysunku :

Warstwa receptorowa sþuŇy do Ðrozpoznawania" oznaczanego zwiĢzku, a

przetwornik do Ðprzetþumaczenia" sygnaþu biologicznego na parametr

mierzalny fizycznie.

Receptorem mogĢ byę:

* enzymy

(Ich wyjĢtkowa rola w przyrodzie to obniŇanie bariery energii aktywacji

okreĻlonej reakcjiÎjak regulatory. WyrŇniajĢ siħ wysokĢ selektywnoĻciĢ

wzglħdem substratu oraz þĢczĢ w sobie rozpoznanie i wzmocnienie, co jest

niezwykle waŇne przy konstrukcji sensorw enzymatycznych.

NajczħĻciej stosowane metody immobilizacji (unieruchomienie)enzymw

to:

- fizyczna immobilizacja w membranie do dializ

- immobilizacja w materiale Ňelowym

- kowalencyjne zwiĢzanie z matrycĢ ŇelowĢ

- bezpoĻrednie zwiĢzanie kowalencyjne z powierzchniĢ np. sensora)

*bakterie

(Wykorzystanie mikroorganizmw jako biologicznych elementw

biosensorw nie jest obecnie tak zaawansowane. StwarzajĢ one szerokie

moŇliwoĻci w analizie zþoŇonych mieszanin, kontroli procesowej,

monitorowaniu Ļrodowiska, szacowaniu toksycznoĻci i wykrywaniu

mutagenw. Sensory mikrobiologiczne wykazujĢ lepszĢ czuþoĻę, ale gorszĢ

selektywnoĻę w porwnaniu do biosensorw enzymatycznych, Biosensory

z zastosowaniem bakterii wykonuje siħ przez fizyczne zwiĢzanie wymazu

komrek bakterii na powierzchni elementu detekcyjnego. Zazwyczaj

komrki bakterii sĢ unieruchomione membranĢ do dializ lub innymi typami

membran mikroporowatych, przez ktre moŇe penetrowaę analizowana

substancja.)

*Tkanki

(Biosensory wykorzystujĢce tkanki roĻlin i zwierzĢt wykonuje siħ,

umieszczajĢc cienki plaster tkanki na koıcwce sensora i zabezpieczajĢc

porowatĢ membranĢ. W porwnaniu do biosensorw bakteryjnych, te

wykorzystujĢce tkanki wykazujĢ lepszĢ selektywnoĻę, poniewaŇ mniej

przeszkadzajĢcych enzymw jest w matrycy tkankowej. Przykþadem moŇe

byę glutaminowy sensor, gdzie cienki wycinek nerki umocowano na

koıcwce amoniakalnej elektrody gazowej i zabezpieczono nylonowĢ

membranĢ.)

*receptory

(Biosensory wykorzystujĢce receptory uzyskujĢ swojĢ selektywnoĻę w

wyniku naturalnego powinowactwa wþaĻciwych biaþek lub fragmentw

protein do specyficznych substancji, zwanych ligandami dopeþniajĢcymi

(jony ujemne lub czĢsteczki zwiĢzane z jonem centralnym w zwiĢzkach

kompleksowych). W biosensorach wykorzystujĢcych receptory jako

materiaþ biologiczny po etapie czĢstkowego rozpoznania nie zachodzi

reakcja chemiczna. WiħkszoĻę biosensorw wykorzystuje receptory z

zastosowaniem poĻredniego typu detekcji.)

Przetworniki to zwykle :

* Elektroda potencjometryczna

- elektroda pH

* Elektroda amperometryczna

- elektroda tlenowa

* Optyczna

- Ļwiatþowd

* Pþprzewodnikowa

- tranzystor

Gþwnym zadaniem przetwornika jest konwersja mierzonego parametru

na sygnaþ: elektryczny, optyczny lub akustyczny.

JednĢ z elektrod o ktrej bħdħ mwię jest elektroda tlenowa ktra wþaĻnie

naleŇy do sensorw amperometrycznych:

Sensory amperometryczne sĢ grupĢ sensorw elektrochemicznych,

wykorzystujĢcych zaleŇnoĻę mierzonego prĢdu od stħŇenia oznaczanej

substancji. W amperometrii wykorzystuje siħ wþasnoĻci charakterystyki

prĢdowo-napiħciowej odpowiednio wykonanej elektrody, w ktrej dla

pewnego zakresu przyþoŇonych napiħę prĢd jest praktycznie niezaleŇny od

wartoĻci napiħcia. WartoĻę prĢdu elektrody amperometrycznej jest

zdeterminowana reakcjami zachodzĢcymi na elektrodzie roboczej

najczħĻciej katodzie, zwiĢzanymi z wymianĢ elektronw, w ktrych biorĢ

udziaþ oznaczane substancje. Amperometria znalazþa szerokie

zastosowanie w pomiarach stħŇeı tlenu, gazw toksycznych i wielu

substancji organicznych, gþwnie glukozy. UmoŇliwia pomiar stħŇeı rzħdu

10-8 Î 10-9 mol/l.

Przykþadem jest:

Elektroda tlenowa Clarka, ktra jest sensorem do oznaczania tlenu,

jakkolwiek wprowadzenie niezbħdnych modyfikacji w jej konstrukcji

umoŇliwia opracowanie sensorw do oznaczania innych gazw o

wþasnoĻciach utleniajĢco Î redukujĢcych, jak: H-2S, NO, NO2, Cl2, CO.

Klasyczna elektroda Clarka jest elektrodĢ z ciekþym elektrolitem,

najczħĻciej w postaci wodnego roztworu chlorku potasowego. Anoda jest

wykonana ze srebra, a katoda z metalu szlachetnego: platyny lub zþota

.Rysunek Ideowy ---schemat amperometrycznej elektrody tlenowej

Clarka

Jako materiaþy membran w takich czujnikach stosuje siħ rŇne polimery

(teflon, polietylen, polimery silikonowe) przez ktre tlen þatwo przenika, w

przeciwieıstwie do innych gazowych skþadnikw prbki.

Jako przykþad moŇe posþuŇyę amperometryczny czujnik enzymatyczny do

pomiaru stħŇenia glukozy (elektroda tlenowa z enzymem w czħĻci

receptorowej).

Czujniki te charakteryzujĢ siħ przede wszystkim wysokĢ selektywnoĻciĢ

dla glukozy. Prace nad nimi prowadzone sĢ od wielu lat, poczĢtkowo do

zastosowaı medycznych, a od pewnego czasu rwnieŇ na potrzeby

biotechnologii i przemysþu spoŇywczego.

WykorzystujĢ one elektrodħ tlenowĢ w poþĢczeniu z membranĢ

zawierajĢcĢ oksydazħ glukozy Î enzym utleniajĢcy glukozħ. Na

powierzchni elektrody tlenowej umieszcza siħ warstwħ unieruchomionego

enzymu. Elektrodħ takĢ zanurza siħ w roztworze nasyconym tlenem z

powietrza i rejestruje prĢd poczĢtkowy. Po dodaniu glukozy czħĻę tlenu

dyfundujĢcego do katody jest zuŇywana w reakcji w warstwie

immobilizowanego enzymu, co zmniejsza jego strumieı dyfuzji do

powierzchni katody. Po pewnym czasie procesy na elektrodzie osiĢgajĢ

stan ustalony i rejestruje siħ prĢd koıcowy. Spadek natħŇenia prĢdu jest

wprost proporcjonalny do stħŇenia glukozy. Pomiar spadku natħŇenia

prĢdu dla rŇnych stħŇeı glukozy pozwala wyznaczyę krzywĢ kalibracyjnĢ,

na podstawie ktrej oznaczamy zawartoĻę glukozy w badanej prbce,

zwykle po odpowiednim jej rozcieıczeniu.

Do pomiaru wykorzystuje siħ reakcjħ utleniania glukozy zawartej w

prbce, pod wpþywem oksydazy glukozowej znajdujĢcej siħ w membranie

przepuszczalnej dla glukozy i tlenu, a stanowiĢcej barierħ dla innych

substancji, ktre mogþyby wpþywaę negatywnie na wyniki. W wyniku

reakcji enzymatycznej tlen rozpuszczony w prbce zostaje czħĻciowo

zuŇyty zgodnie z poniŇszĢ reakcjĢ:

Pozostaþa czħĻę tlenu (zaleŇna od stħŇenia glukozy w prbce)dyfunduje w

kierunku ujemnie spolaryzowanej elektrody El-, gdzie ma miejsce

wymiana þadunkw elektrycznych, co jest rwnoznaczne z przepþywem

prĢdu I w obwodzie zewnħtrznym skþadajĢcym siħ ze Ņrdþa napiħcia E i

rezystora R.

MoŇliwe sĢ rŇne sposoby pomiaru glukozy w prbce i odpowiednio do

tego wymagane sĢ odmienne konstrukcje czujnikw glukozy.

W szczeglnoĻci, najprostszy i najtaıszy pomiar odbywa siħ wtedy, gdy

prbka pþynu w postaci pojedynczej kropli zostanie umiejscowiona na

czujniku (czujnik Ðkroplowy"), lub teŇ czujnik zanurzony zostanie w

naczyıku zawierajĢcym prbkħ.

Innym przykþadem jest elektroda optyczna:

Optyczny sensor chemiczny jest urzĢdzeniem, ktre przetwarza

chemicznĢ informacjħ o prbce (np. stħŇenie okreĻlonego skþadnika w

prbce) na sygnaþ uŇyteczny analitycznie.

WiĢzka Ļwiatþa przenoszona jest miħdzy elementami sensora za pomocĢ

wþkien Ļwiatþowodowych. W ten sposb wiĢzka oddziaþuje przez caþĢ

drogħ z granicĢ miħdzy oĻrodkami o rŇnej għstoĻci optycznej, ktre to

oddziaþywanie zachodzi bez strat dziħki zjawisku caþkowitego

wewnħtrznego odbicia.

Biosensory wykorzystujĢce optyczne metody detekcji wykonuje siħ,

unieruchamiajĢc materiaþ biologiczny, np. enzym na powierzchni koıcwki

wþkna Ļwiatþowodowego.

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! MoŇna

wyrŇnię dwie kategorie biosensorw z zastosowaniem detekcji optycznej.

*Pierwsza kategoria, to biosensory wykorzystujĢce reakcjħ chemicznĢ jako

etap poĻredni miħdzy reakcjĢ enzymatycznĢ i wþaĻciwym pomiarem

optycznym.

*W drugiej kategorii, enzymatyczna reakcja zuŇywa lub generuje

optycznie czynne substancje, ktre mogĢ byę monitorowane

optoelektronicznym przez wþkno Ļwiatþowodowe.

!!!!! Przykþadem biosensora optycznego wykorzystujĢcego reakcjħ

immunochemicznĢ jest sensor do pomiaru stħŇenia glukozy.

W detekcji analitu wykorzystuje siħ immunochemicznĢ reakcjħ wypierania

dekstranu z konkanawiliny A przez glukozħ. Aby otrzymaę mierzalny

sygnaþ optyczny, dekstran znaczony jest fluoresceinĢ, a konkanawilina A

immobilizowana jest do wewnħtrznej powierzchni membrany dializyjnej,

przepuszczajĢcej selektywnie glukozħ do wnħtrza przestrzeni pomiarowej.

W ten sposb konkanawilina znajduje siħ poza strefĢ oĻwietlenia z

rdzenia. WzrastajĢce stħŇenie glukozy powoduje wypieranie dekstranu,

ktry dyfunduje do ĻcieŇki optycznej, gdzie wzbudzana jest fluoresceina.

Tak wiħc wzrostowi stħŇenia glukozy towarzyszy wzrost intensywnoĻci

emisji fluorescencji

Innym rozwiĢzaniem w sensorach czuþych na glukozħ jest uŇycie fazy

zawierajĢcej oksydazħ glukozy i fluorofor czuþy na wygaszanie tlenu.

Utlenianie glukozy, katalizowane przez oksydazħ, wymaga udziaþu tlenu,

ktrego zawartoĻę redukowana jest proporcjonalnie do stħŇenia analitu.

Inne to:

Biosensory sĢ urzĢdzeniami zminiaturyzowanymi, co niesie za sobĢ

zmniejszenie czuþoĻci. SĢ wykorzystywane m.in.

-w badaniach Ļrodowiska,

- analityce medycznej

- kontroli procesw technologicznych.

W ochronie Ļrodowiska biosensory mogĢ byę uŇywane do detekcji i

identyfikacji substancji toksycznych i mutagennych w otaczajĢcym

Ļrodowisku. Spadek aktywnoĻci immobilizowanego biokatalizatora moŇe

byę mierzony jako zmniejszenie siħ szybkoĻci reakcji biokatalitycznej.

WielkoĻę tego spadku jest proporcjonalna do stħŇenia wþaĻciwej trucizny.

Oglnie, izolowany biokatalizator enzymatyczny moŇe byę uŇyty jako

wskaŅnik klasy zwiĢzkw. Przykþadem jest wykrywanie fosforanw

organicznych, wykorzystujĢcych inhibitowanie acetylocholinosterazy.

Reakcjħ enzymatycznĢ moŇna monitorowaę elektrodĢ pH, a szybkoĻę

reakcji jest odwrotnie proporcjonalna do stħŇenia zwiĢzkw

fosforoorganicznych. Zjawisko inhibicji enzymu przez zanieczyszczenia

Ļrodowiskowe zostaþo wykorzystane w licznych biosensorach

elektrochemicznych, gdzie aktywna warstwa (membrana, film)

immobilizowanego enzymu jest naniesiona na powierzchniħ

przetwornikw, jak np. elektrody pH, gazowe elektrody tlenowe lub

dwutlenku wħgla oraz inne elektrody jonoselektywne. Enzymy moŇna

immobilizowaę przez proste zabezpieczenie membranĢ do dializy lub

kowalencyjne zwiĢzanie z powierzchniĢ elektrody za pomocĢ np. aldehydu

glutarowego. Krzywe odpowiedzi sensora w okreĻlonym zakresie stħŇenia

substratu sĢ porwnywane z krzywymi odpowiedzi dla analogicznych

prbek, ale zawierajĢcych rwnieŇ zanieczyszczenie.

Do oznaczania oglnej toksycznoĻci roztworu zastosowano biosensory

bakteryjne. W tym przypadku, szybkoĻę metabolizmu ŇyjĢcych komrek

bakterii jest monitorowana elektrodĢ tlenowĢ. Kiedy poziom toksycznoĻci

roĻnie, szybkoĻę respiracji tych immobilizowanych komrek spada i mniej

tlenu jest zuŇywane. Tak wiħc wzrost poziomu tlenu jest oznakĢ wzrostu

toksycznoĻci, a stopieı spadku metabolizmu jest miarĢ tego wzrostu.

Sensory tego typu nie sĢ selektywne na okreĻlonĢ truciznħ lub ich klasħ,

ale umoŇliwiajĢ okreĻlenie oglnego stopnia toksycznoĻci badanej prbki.

Zastosowanie biosensorw w chemii klinicznej grupuje siħ wokþ rozwoju

urzĢdzeı do analiz in vitro oraz do pomiarw stanw krytycznych.

Systemy do pomiarw analitycznych sĢ projektowane do uŇytku w

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: