Genetyka

Ćwiczenie 1

Metody uzyskiwania i analizy chromosomów człowieka

1.      Rodzaje materiału genetycznego do hodowli chromosomów

2.      Pobieranie, przechowywanie i transport materiału do badań cytogenetycznych

3.      Technika hodowli komórek z litych guzów nowotworowych i komórek nowotworowych szpiku

4.      Zasady pracy w laboratorium cytogenetycznym – pokaz i obsługa aparatury

5.      Barwienie chromosomów metoda rutynową  zajęcia praktyczne

6.      Mikroskopowa ocena preparatu cytogenetycznego wybarwionych rutynowo

7.      Zapoznanie się z zasadami komputerowej analizy chromosomów z wykorzystaniem Cytoskanu – komputerowego analizatora kariotypu

Materiały biologiczne do hodowli chromosomów

         Pełna krew obwodowa

         Komórki płynu owodniowego

         Komórki kosmówki (trofoblastu)

         Tkanki poronionego zarodka

         Fibroblasty skóry

         Komórki nowotworowe z wysiękowych płynów nowotworowych

         Fragmenty tkanek guzów nowotworowych

         Komórki nowotworowe pobrane metodą biopsji aspiracyjnej cienkoigłowej

         Szpik kostny (komórki nowotworowe pobrane z biopsji szpiku)

Pobranie materiału do badań cytogenetycznych:

         Musi być pobrane jałowo

         Materiał musi być umieszczony w sterylnym jałowym pojemniku

         Krew pobierana na heparynę.

         Komórki płynu owodniowego przez amniopunkcję:              wczesna:              12-14 tydzień

              późna:              15-17 tydzień

         Komórki trofoblastu (biopsja przez powłoki brzuszne): 8-11 tydzień

         Komórki szpiku z żebra lub talerza kości biodrowej (u dzieci) – natychmiast po pobraniu do płynu hodowlanego o temp 37°C

Pojemniki z próbkami oznaczone muszą być co najmniej 2 danymi identyfikacyjnymi (np. imię i nazwisko oraz data urodzenia)

Optymalna ilość materiału do badań:

Przechowywanie:

Czas przechowywania należy ograniczyć do minimum.

         Krew – nie dłużej niż 24h w temperaturze pokojowej, 3 doby w temperaturze poniżej 4°C

         Płyn owodniowy –nie dłużej niż 24h w temperaturze poniżej 4°C

         Tkanki w pożywce – do 3 dni w temperaturze poniżej 4°C

Tkanki zaraz po pobraniu należy umieścić w pojemniku z podłożem hodowlanym

Transport

W pojemniku z podłożem lub bez w temperaturze 0°C

Hodowla chromosomów z limfocytów krwi obwodowej

Składniki:

         Podłoże Eagle’a

         Fitohemaglutynina M (PHA)

         Sól sodowa heparyny

         Płodowa surowica cielęca

         Penicylina krystaliczna

         Streptomycyna

         Colcemid (kolchicyna)

         KCl (0,075M)

         Płyn Carnoy’a

         Barwnik Giemsy

Przygotowanie płynu hodowlanego

Do sterylnej butelki nalewamy 100ml:

         Płynu Eagle’a

         Fitohemaglutyniny M – 1%

         Penicyliny krystalicznej – 100 IU/ml

         Streptomycyny – 100 μg/ml

1)     Zakładanie makrohodowli

Hodowlę komórkową zakładamy w sterylnym jednorazowym naczyniu hodowlanym NUNC o pojemności 25ml w warunkach jałowych (komora laminarna)

a)      do sterylnej probówki z 1 ml heparyny (50 IU/ 1ml krwi) pobieramy 10 ml krwi żylnej. Odstawiamy do sedymentacji na około 2h w temperaturze pokojowej

b)     osad białych krwinek wraz z 1 ml osocza przenosimy do naczynia hodowlanego z 8ml płynu hodowlanego oraz 1ml surowicy płodowej cielęcej. Naczynie należy szczelnie zamknąć, krańcowa objętość hodowli wynosi 10ml

c)      umieścić naczynie hodowlane w cieplarce o temperaturze 37°C na okres 48-72h, każdego dnia hodowlę mieszamy

d)     na 2h przed zakończeniem hodowlę wyjmujemy z cieplarki, dodajemy colcemidu
0,15 μg/ml i wstawiamy ponownie do cieplarki na 2h

2)     Wykańczanie hodowli:

a)      zawartość hodowli przenosimy do wirówki – 7min, 800obr/min

b)     zlewamy płyn znad osadu, probówkę wstrząsamy, kroplami dodajemy 10ml 0,075M KCl (0,55%), na 17min w temperaturze pokojowej, wirujemy 7 min, 800obr/min

c)      zlewamy płyn znad osadu, do osadu dodajemy 10ml płynu Carnoy’a (mieszanina metanolu i kwasu octowego lodowego w stosunku 3:1). Probówkę umieszczamy na 10 min w lodówce. Wirujemy 3 razy po 7 min, 800obr/min

d)     po zlaniu płynu znad osadu osad nanosimy na oziębione szkiełka podstawowe

e)      po wysuszeniu barwimy preparat barwnikiem Giemsy

Mikrohodowla – zakładanie

Mikrohodowla jest stosowana powszechnie w rutynowej diagnostyce noworodków i małych dzieci.

         Odczynniki jak w markohodowli

         Przygotowanie płynu komórkowego – jak w markohodowli

         Zakładanie mikrohodowli:

o       Wysterylizowane buteleczki po penicylinie o pojemności 5ml lub w naczyniach plastykowych

o       Do 2ml płynu dodajemy 4 krople (0,3-0,5ml) pełnej krwi obwodowej (pobranej z pięty lub żyły ciemieniowej)

o       Hodowla 72h, z zachowaniem tych samych procedur co w makrohodowli

Hodowla chromosomów z komórek szpiku ludzkiego

Bioptat szpiku (1-2ml) należy umieścić natychmiast po pobraniu w jałowej probówce z ogrzanym do 37°C płynem hodowlanym (np. RPMI 1640) z dodatkiem 15% płodowej surowicy cielęcej oraz antybiotykami (penicylina, streptomycyna) w standardowych stężeniach. Dodatkowo należy dodać heparynę 250 IU/ml

Dwie drogi postępowania:

a)      metoda uzyskiwania chromosomów bezpośrednio po pobraniu

b)     metoda krótkotrwałej hodowli

a) metoda uzyskiwania chromosomów bezpośrednio po pobraniu

Polega na inkubacji komórek szpiku przez 1-2h w pożywce z colcemidem (25μg/ml). Jest zalecanym postępowaniem w przypadkach ostrych białaczek szpikowych i limfatycznych

b)metoda krótkotrwałej hodowli

hodowlę komórek zakładamy w w/w płynie hodowlanym stosując rozcieńczenie komórek szpiku kostnego – milion/ml hodowli. Komórki hoduje się przez 24-48h w temperaturze 37°C, w atmosferze z 5% CO2.

         Mitozy blokujemy colcemidem 5-10μg/ml na 40-60 min przed końcem hodowli

         Szok hipotoniczny – w celu odpowiedniego rozproszenia chromosomów w jądrze używamy 0,4% KCl lub mieszaniny 3g KCl, 4,8g HEPES, 0,2g EGTA w 1000ml wody o pH 7,4

Dalsze etapy utrwalania i wykańczania podobne jak w standardowych technikach cytogenetycznych.

W przypadkach białaczek, gdy komórki nowotworowe występują we krwi obwodowej stosuje się 24-48h niestymulowaną mitogenami hodowlę komórek pobranych drogą nakłucia żylnego.

Zasady barwienia takie same jak chromosomów z innych tkanek.

Hodowla chromosomów z tkanek pochodzących z guzów nowotworowych

Transport guza:

         Jałowe naczynie

         Płyn Hawksa lub Eagle’a ewentualnie 0,9% NaCl z dodatkiem antybiotyków: penicyliny krystalicznej (100 IU/ml), streptomycyny (100μg/ml)

Przygotowanie tkanek guza:

         1-3cm3 guza przenosimy na szalkę Petriego

         Rozdrabniamy tkankę nożyczkami

         Dodajemy 2ml płynu Hawksa z antybiotykami i dalej rozdrabniamy

Skład płynu hodowlanego (100ml)

         Płyn RPM z penicyliną (100 IU/ml) i streptomycyną (100μg/ml)

         10-15% surowica płodowa cielęca

         1ml L-glutaminy

Przenoszenie tkanek guza do naczynia hodowlanego NUNC, w którym znajduje się 5ml płynu hodowlanego, 1ml kolagenazy o stężeniu 150-200 IU/ml. Całość trzymamy w cieplarce (37°C, 24h, 5%CO2)

         Po 24h rozpipetowujemy do probówki wirowniczej

         Dodajemy 10ml płynu RPM z antybiotykami

         Wirujemy 10min 1000obr/min

         Po odwirowaniu dodajemy 1,5ml płynu RPM

Zakładanie hodowli:

Hodowla w temperaturze 37°C,  z przepływem 5%CO2. Codziennie oglądamy w mikroskopie odwróconym wzrost kolonii.

UWAGA!: co 2-3 dni zmiana płynu hodowlanego

Zakończenie hodowli

         Przy widocznych mitoza (po kilku, kilkunastu dniach i więcej), 30min – 2h przed zakończeniem hodowli colcemid 5-10μg/ml

         Komórki z hodowli zdrapujemy „drapaczką”

         Całość zalewamy do probówki wirowniczej, wirujemy 10 min 1100obr/min

Przeprowadzenie szoku hipotonicznego:

Skład płynu hipotonicznego:

Szok hipotoniczny przeprowadzamy w temperaturze 37°C przez 45min. Następnie wirujemy 10min 1100obr/min

Utrwalanie materiału komórkowego

         Metanol : lodowy kwas octowy 3:1, powtarzamy 3x po 20 min

         Wirowanie 10min 1100obr/min

         Nanosimy na zimne (wyjęte z wody z lodem) szkiełka podstawowe

Dodatkowe czynności, które mogą być wykonane w czasie prowadzenia hodowli:

●       przy szybkim wzrosćie komórek (możliwość zahamowania wzrostu komórek) – możliwość pasażowania przy użyciu roztworu trypsyny (otrzymujemy 2 hodowle z jednej)

●       przy braku przyczepu komórek do ścian naczynia zakładamy ponownie hodowlę w naczyniach z kolagenem

●       nadmiar erytrocytów – płuczemy hodowlę w płynie niszczącym erytrocyty(NH4Cl, NaHCO3, EDTA)przez 15min w autoklawie

Wybarwienie prążków G w chromosomach metafazowych:

●         Do barwienia na prążki G używamy preparatów chromosomowych świeżych (4-10dni)

●         preparaty poddajemy trawieniu roztworem trypsyny o stężeniu 0,25%-0,5% w buforze Sorensena o pH 6,8

Odczynniki:

...