Temat 2: Diagnostyka molekularna chorób genetycznych cz I.. Zastosowanie technik biologii molekularnej w diagnostyce chorób.

1.      Pozyskiwanie DNA do celów diagnostycznych.

2.      Pobieranie i przechowywanie materiału biologicznego.

3.      Zasady izolacji DNA i RNA

4.      R. Łańcuchowe polimerazy PCR

5.      Analiza produktu r. PCR

6.      Ocena ekspresji genów z zastosowaniem mikro- i makromacierzy DNA

Materiał wyjściowy do izolacji DNA

-          pełna krew obwodowa

-          komórki płynu owodniowego

-          komórki kosmówki

-          fibroblasty skory pochodzącej z hodowli

-          komórki epitelialne

-          cebulki włosowe

-          plamy krwi, nasienie

-          wycinki tkanek np. tk. Nowotw. Uzyskiwane pooperacyjnie, pobrane met. Biopsji cienkoigłowej

-          szpik kostny

-          płyn mózgowo-rdzeniowy

Krew pobieramy na antykoagulant (EDTA, 2,3 ml krwi)

Przechow. – w temp 4 st. do 48 godz, jeśli od pacjenta – zamrażamy do - 70 st

Plamy z wydzieliny w temp. pokojowej

Wyizolowany DNA  w temp – 4st, jeśli dłużej przechow. to w - 20st

Etapy izolacji DNA met. fenolowa

1.      pobieranie krwi obwodowej na EDTA

2.      oddzielenie osocza przez wirowanie

3.      liza erytrocytów

4.      liza leukocytów z wykorzystaniem detergentu jonowego np. SDS, która rozpuszcza bł. kom.

5.      trawienie białek przy użyciu proteinazy K w temp 37st., 24- 48 godz. (najczęściej przez noc)

6.      oczyszczenie lizatu mieszanina fenol- chloroform- oktanol (25:24:1)

7.      precypitacja DNA (wytracanie) 96% etanolem

8.      zawieszenie preparatu DNA w buforze, który zabezpiecza przed działaniem endonukleaz

DNA otrzymany tą met. może być wykorzystany w podst. badaniach diagnostycznych z zakresu biologii molekularnej.

Zalety met. Fenolowej

-          dobra wydajność – otrzymuje się DNA o dużym stężeniu

-          wysoka czystość otrzymanego preparatu

-          możliwość izolacji DNA z krwi długo przechowywanej (ok. 1 roku)

Wady met. Fenolowej

-          długi czas izolacji – 2-3 dni

-          naraża na prace z toksycznymi odczynnikami

Metoda z odsalaniem białka

Różnice w stosowaniu do metody fenolowej

-          wyższa temperatura inkubacji z proteinaza K – 55st

-          skrócony czas trwania do 12- 24 godz., a tym samym i czas uzyskania preparatu DNA

-          odbialczenie DNA zachodzi w wyniku odsalania białek poprzez odwodnienie i wytracenie z użyciem nasyconego roztworu NaCl

-          precypitacja 70%etanolem

Zalety stosowania metody wysalania

-          prosta i tania

-          krótszy czas izolacji – 2 dni

-          rezygnacja z toksycznych odczynników

-          możliwość zmniejszenia ilości pobranej krwi

Wada: niska wydajność izolacji DNA z krwi długo przechowywanej

Metoda Grimberga

Zalety

-          rezygnacja z fenolu i chloroformu

-          krotki czas izolacji – 6godz

-          duża wydajność

-          możliwość uzyskiwania DNA z bardzo małych ilości krwi ok. 1 ml

Wady:

-          zanieczyszczenie preparaty DNA glikozoaminoglikanami, brak zanieczyszczeń RNA i białkami

-          nie nadaje się do izolacji z izotiocyjaninem guanidyny

Metoda izolacji z izotiocyjaninem guanidyny

Zalety:

-          krotki czas wykonywania – kilka godz.

-          wydajność przekracza prawie 2- krotnie wydajność tradycyjnej met. Fenolowej

Metoda izolacji za pomocą gotowych zestawów odczynnikowych tzw. KIT-ow

Gotowe zestawy służą do szybkiej i uproszczonej izolacji DNA, upraszczają procedury, ale są bardzo drogie.

Ocena ilości i jakości wyizolowanego DNA

Na podstawie pomiaru absorpcji 260nm oblicza się stężenie preparatu DNA wg. wzoru

Z= A260 x 50 x R

Z – stężenie wyizolowanego DNA w roztworze (ug/ml)

R – rozcieńczenie

50 – stały współczynnik dla dwuniciowego DNA. Jedna jednostka absorpcyjna równa się 50 ug DNA/ml

Częstość preparatu ocenia się na podstawie proporcji wartości absorbancji przy długości fali 230 nm, 260nm, 280nm.

Uzyskany preparat DNA charakteryzuje się wartości.

A260/A280 wynosząca 1,7- 2,0

A260/A280 <2 preparat zanieczyszczony RNA i białkiem

A260/A230 >2 preparat zanieczyszczony mukopolisacharydami

Izolacja RNA:

1.      pobranie krwi na antykoagulant (EDTA)

2.      „zbieranie” leukocytów – nawarstwianie fikolu

3.      Odwirowanie – pozostaje zawiesina leukocytów

4.      Płukanie leukocytów w roztworze PBS

5.      Wirowanie

6.      Dodanie PBS i tiocyjanianu guanidyny

7.      Wirowanie

8.      Właściwe oczyszczanie – dodajemy azotanu sodu, fenolu i mieszaniny chloroformu z alkoholem izoamylowym

9.      Inkubacja 0C przez 15min

10.  Wirowanie i płukanie alkoholem

11.  Przechowywanie w buforze lub sterylnej wodzie

Oznaczenie stężenie spektrofotometrycznie

Technika sekwencjonowania na żelach (elektroforeza)

DNA migruje w kierunku bieguna dodatniego

Najmniejszą rozdzielczość mają żele agarozowe – 0,1-60kpz

Wykorzystanie:

·         Sprawdzenie, jaki preparat DNA uzyskaliśmy

·         Czy badane DNA zostało pocięte przez enzymy

·         Do oceny reakcji PCR

Żel poliakrylamidowy: duża rozdzielczość, >0,1 kpz,

Żele PAGE – do rozdziału DNA otrzymanych podczas sekwencjonowania, gdzie cząsteczki DNA różnią się od siebie o 1 nukleotyd

Łańcuchowa reakcja polimerazy

PCR- enzymatyczna amplifikacja in vitro fragmentu genów DNA o długości od kilkudziesięciu do kilku tysięcy par zasad.

Startery – jednoniciowe oligonukleotydy (ok. 20 zasad), syntetyzowane chemicznie Sekwencja nukleotydów jest komplementarna do końców 3’ obu nici wybranej sekwencji matrycowego fragmentu DNA, które ma być powielona z wielokrotnej kopii.

Amplifikacja DNA w reakcji PCR odbywa się przy udziale polimerazy DNA wyizolowanej z termofilnych bakterii np. polimeraza Tag z Thermas aquaticus jest aktywna w mieszaninie reakcyjnej o temp. 95 st.

Reakcja PCR prowadzona jest w cyklach powtarzających się 20 – 40 razy. W każdym cyklu następuje etap denaturacji cząsteczki DNA, przyłączanie starterów i syntezy nowej nici DNA. Każdy etap zachodzi w innej temperaturze i trwa ok. 15- 60 sek.

Reakcja zachodzi w próbówce umieszczonej w bloku grzejnym (termocykler), który umożliwia szybka i precyzyjna zmianę temperatury, właściwa dla poszczególnych etapów procesu PCR.

Skład mieszaniny reakcyjnej:

·         Matrycowy DNA (lub RNA)

·         Startery komplementarne do łańcucha i ograniczające długość syntetyzowanego łańcucha

·         Tri fosforany czterech deoksyrybonukleotydów (dNTP)

·         Termostabilna polimeraza Taq

·         Odpowiedni bufor

·         Jony Mg2+ - ko faktor aktywności enzymatycznej polimerazy

Objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 20-100ul

Etapy reakcji PCR:

·         Denaturacja matrycowego DNA w temperaturze 94C

·         Przyłączanie starterów do jednoniciowych matryc DNA w temperaturze 40-68C (im więcej par GC tym wyższa temperatura przyłączania)

·         Synteza DNA – wydłużanie starterów przy udziale polimerazy Taq w temperaturze 72C z wykorzystaniem dNTP – elongacja

Podniesienie temperatury 72C po zakończeniu elongacji do temperatury denaturacji DNA rozpoczyna kolejny cykl, proces ten może być powtarzany 25-40x. Po każdym cyklu następuje podwojenie amplifikowanego materiału. Nowo powstające produkty PCR są również matrycą do syntezy następnych. Końcową ilość namnożonych kopii fragmentu DNA można obliczyć ze wzoru:

              I=I0x2n ,gdzie:

I, I0 – końcowa i początkowa ilość kopii powielanego odcinka DNA

n – ilość cykli

zalety:

·         Szybka do przeprowadzenia: 2,5-4h

·         Klonowanie pojedynczych genów

·         b. duża czułość i specyficzność metody

wady:

·         b. duża czułość i specyficzność (przy zanieczyszczonej próbce, może to prowadzić do błędnych wyników)

zastosowania PCR:

·         wykrywanie patogenów infekcyjnych: bakterii, wirusów, pasożytów

·         wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach genetycznych

·         preimplantacja i prenatalna diagnostyka chorób genetycznych

·         wykrywanie uszkodzeń DNA spowodowanych czynnikami środowiskowymi

·         wykrywanie predyspozycji do chorób nowotworowych, monitorowanie i wykrywanie nowotworów

·         wykrywanie polimorfizmu sekwencji DNA na potrzeby identyfikacji indywidualnej, ustalanie ojcostwa, identyfikacja sprawców przestępstw

·         badania głównego systemu zgodności tkankowej w celu prawidłowego doboru dawców i biorców

Warianty reakcji PCR:

rt-PCR:

proces PCR jest poprzedzany przepisaniem sekwencji mRNA na cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji. Jest to technika amplifikacji genów, w której materiałem wyjściowym jest mRNA lub całkowity RNA komórki

Multiplex PCR

Wielomiejscowa reakcja PCR, umożliwia jednoczasową amplifikację kilku fragmentów DNA w mieszaninie reakcyjnej

Nested PCR

Wewnętrzna reakcja PCR: prowadzi się dwie rundy reakcji, do każdej stosuje się dwie pary primerów: zewnętrznych i wewnętrznych, tak że druga para jest umieszczona wewnętrznie w stosunku do pierwszej. Pierwsza runda to standardowe PCR prowadzona przez 15-20 cykli. Mała porcja tak otrzymanej mieszaniny reakcyjnej jest rozcieńczana i poddawana drugiej rundzie amplifikacji przez 15-20 cykli. Poprawia się dzięki temu specyficzność i czułość reakcji PCR

Real time PCR

Tzw „w czasie rzeczywistym”, po każdej replikacji (powieleniu) informuje ile jest kopii DNA