Podstawy cytometrii przeplywowej - oznaczanie subpopulacji komorek.pdf
(
643 KB
)
Pobierz
Podstawy cytometrii przep³ywowej - oznaczanie subpopulacji komórek
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Przeciwciała (Ab)
białka należące do frakcji gammaglobulin
syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty
B) w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla
rozpoznawanego Ag.
Przeciwciała monoklonalne (mAb)
skierowane przeciwko jednej
determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce
wiązania Ag z Ab)
Odgrywa zasadniczą rolę w fenotypowaniu komórek
immunokompetentnych człowieka.
Jest to możliwe dzięki szerokiemu panelowi dostępnych
przeciwciał monoklonalnych (mAb) skierowanych
przeciwko obecnym na komórkach Ag różnicowania,
CD
(cluster of differentiation)
, którymi znakuje się
struktury w zawiesinie komórek poddawanych analizie.
Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie
- łańcuchy ciężkie
żółte
- łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/żółte - regiony zmienne
jasnoniebieskie/żółte - regiony stałe
szare
- mostki dwusiarczkowe
Ocena subpopulacji komórek tą techniką jest obiektywną
i powtarzalną metodą diagnostyczną.
CYTOMETR PRZEPŁYWOWY
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Analiza wieloparametrowa jednej
komórki w aparacie, w momencie
gdy ruch komórek w cieczy jest
uporządkowany
ִ
komórki się nie zlepią, będą
oddzielne w słupie
ִ
na pojedynczą komórkę pada
laser w komorze pomiarowej
PRZEPŁYW KOMÓREK W APARACIE
MIERZONE PARAMETRY
tu nakładamy
próbkę
Podstawowym pomiarem jest rejestrowanie światła
rozproszonego na komórce oraz światła wysyłanego przez
wzbudzony fluorochrom. Detektory mierzą światło rozproszone.
ciecz osłaniająca
FSC (forward scatter)
pomiar światła rozproszonego, mierzonego w
przedłużeniu promienia lasera, światło pada prawie pod katem 0
⁰
charakteryzuje wielkość komórki
fluorescencja
SSC (side scatter)
pomiar światła rozproszonego, mierzone pod kątem
90
⁰
pozwala na analizę ziarnistości komórki
promień
lasera
lasera
Oprócz parametrów opisujących rozproszenie światła, istotnym pomiarem
jest ocena intensywności fluorescencji
FL (FL1, FL2…)
. Pomiar
fluorescencji zależy od autofluorescencji komórek oraz użytych fluorochromów.
Purdue University Cytometry
Laboratories
1
promie
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
BUDOWA CYTOMETRU
DETEKTORY FLUORESCENCJI
układ transportu cieczy
powiązany z układem
powietrznym
układ optyczny
: laser argonowy, filtry przepuszczające
promienie światła tylko o określonej długości
laser
detektor
przedni
układ elektroniki
: fotopowielacze, wzmaczniacze,
przetwornik analogowo cyfrowy
Fluorescence
detektory fluorescencji
(PMT3, PMT4 etc.)
OCENIANE PARAMETRY
OCENIANE PARAMETRY
STRUKTURALNE
rozmiar
FUNKCJONALNE
ł
adunek powierzchniowy
rozmiar
kszta
adunek powierzchniowy
ekspresja receptor
kształt
cytoplazmatyczna ziarnisto
ekspresja receptoró
w powierzchniowych
w powierzchniowych
cytoplazmatyczna ziarnisto
ść
ść
integralno
ść bł
ony (
ony (ż
ywotno
ywotno
ść
ść)
barwnika np.: hemoglobina, barwniki
fotosyntetyczne, porfiryny
ść
barwnika np.: hemoglobina, barwniki
endocytarna
organizacja
ść
endocytarna
fotosyntetyczne, porfiryny
aminokwasy fluoryzuj
aminokwasy fluoryzują
ce w bia
ce w biał
kach
kach
np.:tryptofan
np.:tryptofan
,
,
organizacja
cytoszkieletu
cytoszkieletu
tyrozyna
zawarto
aktywno
ść
enzym
enzymów
zawarto
ść
ść
DNA, RNA, wszystkich bia
DNA, RNA, wszystkich biał
ek, lipid
ek, lipidó
w,
w,
cukró
w powierzchniowych, antygen
w powierzchniowych, antygenów
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Zalety cytometrii
:
- szybki, obiektywny i zautomatyzowany pomiar pojedynczych
komórek w dużych populacjach komórkowych, z dużą
powtarzalnością
- wykrywanie śladowych subpopulacji
- równoległa ocena kilku parametrów
- ilościowa i jakościowa ocena stanu układu immunologicznego,
poszczególnych populacji
Schematyczny rozkład leukocytów
na cytogramie FFC/SSC
Wady
:
- niemożność korelacji wyników pomiarów fluorescencji z morfologią
komórek
- technika przygotowania materiału do badań, wymagająca izolacji
z tkanki pojedynczych komórek
- wysoki koszt badań
FL1 (izotiocyjanian
fluoresceiny FITC)
2
STRUKTURALNE
integralno
ść
zawarto
ść
zawarto
aktywno
aktywno
ść
tyrozyna
aktywno
ść
cukr
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
Antygeny różnicowania CD
CD
Występowanie
Funkcja
CD2
Limfocyty T, tymocyty, komórki
NK
Adhezja T do APC,
kostymulacja
CD2R
Aktywowane limfocyty, NK
Aktywacja limfocytów T
CD3
Limfocyty T
Przekazywanie sygnału do
limfocytów T
CD4
Limfocyty T pomocniczne (Th),
monocyty (Mo), makrofagi (MØ),
tymocyty
Koaktywacja limfocytów
Th
CD8
Limfocyty T cytotoksyczne (CTL),
tymocyty
Koaktywacja limfocytów
CTL
CD14
Monocyty (Mo), granulocyty,
komórki Langerhansa, makrofagi
(MØ)
Białko wiąŜące LPS
CD19
Limocyty B, komórki preB
Aktywacja i proliferacja
limofocytów B
CD20
Limocyty B, komórki preB
Kanał Ca
2+
, regulacja,
aktywacja i proliferacja
limfocytów B
CD45
Leukocyty
Fosfataza tyrozynowa
biorąca udział w
przekazywaniu sygnałów
CD45RO
Aktywowane limfocyty T,
monocyty, makrofagi, granulocyty,
tymocyty
Markery limfocytów T
pamięci immunologicznej
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJĄDROWYCH KRWI OBWODOWEJ
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJĄDROWYCH KRWI OBWODOWEJ
Podstawowe markery i cechy fenotypowe linii komórkowych
MONOCYTY
CD45 -
marker wszystkich leukocytów
CD19, CD20 -
markery limfocytów B
CD3, CD7 -
markery limfocytów T
CD4
- marker limfocytów T pomocniczych
CD8
- marker limfocytów T supresorowych
CD56
- marker komórek NK
CD25, CD71, CD69 -
markery aktywacji limfocytów
CD13, CD33
ִ
mAb: CD45-FITC/CD14-PE
ִ
stanowią 2-4% wszystkich leukocytów
ִ
maj
ą
zdolno
ść
do ruchu pe
ł
zakowatego i mog
ą
wydostawa
ć
si
ę
ze
ś
wiat
ł
a naczy
ń
krwiono
ś
nych
ִ
po przejściu do tkanek dojrzewają i przekształcają się w MØ
ִ
komórki
ż
erne
ż
yj
ą
ce oko
ł
o 4 dni
-
markery różnicowania mieloidalnego
CD15
- marker granulocytów
CD14
- marker monocytów
CD34
- podstawowy marker komórek progenitorowych
(macierzystych)
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJĄDROWYCH KRWI OBWODOWEJ
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJĄDROWYCH KRWI OBWODOWEJ
LIMFOCYTY B
LIMFOCYTY T
ִ
mAb: CD2-FITC/CD19-PE
ִ
postają i dojrzewają w szpiku
ִ
bardzo dużo limfocytów B występuje w czasie infekcji
bakteryjnych
ִ
wiążą Ag za pomocą receptora BCR, następnie przetwarzają go i
„wystawiają” na powierzchnię komórki w postaci kompleksu z
białkami MHC. Kompleks ten jest rozpoznawany przez swoisty
względem danego antygenu limfocyt T pomocniczy. Wtedy
dochodzi do transformacji blastycznej i powstaniu komórki
plazmatycznej produkującej Ab. Ag, które powodują taki typ
reakcji nazywamy
antygenami grasicozależnymi
. W odróżnieniu
od nich,
antygeny grasiconiezależne
nie wymagają obecności
limfocytów T pomocniczych i mogą bezpośrednio aktywować
limfocyty B.
ִ
T pomocnicze T helper (Th):
mAb: CD3FITC/CD4PE
wspomagają odpowiedź immunologiczną poprzez wydzielanie
mediatorów regulujących funkcje układu odpornościowego
(cytokin) lub poprzez bezpośredni kontakt z innymi
komórkami
trzy subpopulacje komórek Th: Th0, Th1 i Th2
ִ
T supresorowe (Ts):
mAb: CD3FITC/CD8PE
są odpowiedzialne za hamowanie reakcji immunologicznej
3
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJĄDROWYCH KRWI OBWODOWEJ
OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKŁADU
ODPORNOŚCIOWEGO
KOMÓRKI NATURAL KILLER (NK)
monitorowanie chorób autoimmunizacyjnych, leczenia
immunosupresyjnego, po przeszczepach, niedoborów odporności,
głównie przez ocenę struktur powierzchniowych komórek, rzadziej
antygenów wewnątrzkomórkowych
ִ
mAb: CD3FITC/CD56PE
ִ
posiadają właściwości cytotoksyczne
ִ
ważne w odporności przeciw komórkom nowotworowym oraz
komórkom zarażonym przez wirusy
ִ
działają nieswoiście (wykazują właściwości cytotoksyczne bez
wcześniejszej immunizacji)
IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW
niezbędne w monitorowaniu:
-
wrodzonych zaburzeń odpowiedzi humoralnej, związanych z
niedoborem limfocytów B: określa się liczbę komórek cechujących
się występowaniem markerów CD19/CD20, będących wykładnikiem
tej populacji
OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKŁADU
ODPORNOŚCIOWEGO
Zakres wartości prawidłowych markerów komórek
jednojądrowych krwi obwodowej człowieka
IMMUNOFENOTYPOWANIE
LIMFOCYTÓW
niezbędne w monitorowaniu:
LIMFOCYTY
CD4+CD8+
Komórki-marker CD Wartość średnia
[%]
Zakres wartości
[%]
CD4+
45
35-50
kondycji immunologicznej chorych z
nabytym niedoborem odporności (HIV
pozytywnych): ocena subpopulacji
limfocytów CD4 i CD8 oraz
współczynnika CD4/CD8 np.:
C
D
4
CD8+
35
25-45
CD3+
50
35-65
CD2
55
45-65
LIMFOCYTY CD4-
CD8+
CD22
25
20-30
CD56
15
10-20
CD14
18
10-25
44%/27% zdrowy (1,63)
7,7%/54% pacjent z pełnoobjawowym
niedoborem odporności (0,14)
Wskaźnik CD4/CD8
1,4
1,1-1,7
CD8
OCENA SUBPOPULACJI pacjent1
ANALIZA
CYTOMETRYCZNA
Kontrola izotypowa
Limf.T CD8
CYTOMETRYCZNA
Limf.T CD4
Limfocyty B
monocyty
4
ANALIZA
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
OCENA SUBPOPULACJI pacjent2
Kontrola izotypowa
LimfocytyT CD8
LimfocytyT CD4
Limfocyty B
monocyty
Komórki NK
(Natural Killer)
5
Plik z chomika:
kosmetologia_umed
Inne pliki z tego folderu:
Immunologia_208_pytania.doc
(28 KB)
izolacja, barwienie i roznicowanie komorek ukl. immunologicznego.pdf
(2304 KB)
Metody oceny chemotaksji, fagocytozy..pdf
(1724 KB)
metody oznaczania Ab i dopelniacza.pdf
(1105 KB)
Metody oznaczania autoAb.pdf
(1108 KB)
Inne foldery tego chomika:
CHSK
DERMATOLOGIA
DIETETYKA
EKONOMIKA
FIZYKOTERAPIA I MASAŻ
Zgłoś jeśli
naruszono regulamin