Elektroforeza.docx

Elektroforeza

B

iałka powstałe na matrycy mRNA są osta-tecznym produktem ekspresji genów, a ana-liza ekspresji białek stanowi jedną z pod-stawowych metod biologii molekularnej. W celu przeprowadzenia analizy białek stosuje się elek-troforezę, podczas której cząsteczki białka, obar-czone określonym ładunkiem, migrują w polu elektrycznym. W połowie lat sześćdziesiątych ubiegłego stulecia została opracowana metoda elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS-PAGE (ang. sodium dodecyl sulfate polyacryla-mide gel electrophoresis), która pozwala na roz-dział białek zgodnie z ich ładunkiem, wielkością i kształtem. Aby zidentyfikować określone białko, zawarte w mieszaninie innych białek, sto-suje się metodę western-blot.

Hybrydyzacja western-blot, określana również jako immuno-blotting, jest procedurą, w której różne rodzaje białek są rozdzielane przy wykorzystaniu elektroforezy SDS-PAGE i prze-noszone na trwałą „podstawę”, jaką jest mem-brana. Następnie, poprzez inkubację tej mem-brany ze specyficznym przeciwciałem pierwszo-rzędowym, następuje identyfikacja poszukiwa-nego białka.

Metoda ta, z uwagi na jej czułość i do-kładność, znalazła szerokie zastosowanie w ilo-ściowej analizie białek. Pozwala jednocześnie na uzyskanie informacji na temat rodzaju, wielkości białka oraz poziomu jego ekspresji - danych tych nie można uzyskać przy użyciu innych, alterna-tywnych technik (Wu i in., 2004).

Standardowa hybrydyzacja western-blot składa się z czterech etapów:

• rozdział białek przy wykorzystaniu elektroforezy SDS-PAGE,

transfer białek z żelu na membranę,

• inkubacja membrany ze specyficznym przeciwciałem,

• detekcja białek na membranie.

Rozdział białek przy wykorzystaniu elektroforezy SDS-PAGE

Aby rozdzielić białka na podstawie róż-nic w ich ciężarze cząsteczkowym należy prze-prowadzić elektroforezę w żelu poliakryloami-dowym, w warunkach denaturujących, w obec-ności siarczanu dodecylu sodu (SDS) i β-mer-kaptoetanolu.

Siarczan dodecylu sodu, SDS, jest silnym, anionowym detergentem zbudowanym z hydro-filowej „głowy” oraz długiego hydrofobowego „ogona” (CH3-(CH2)11-SO4-Na+). Detergent SDS przyłącza się do hydrofobowych obszarów cząsteczki białka i powoduje jej „rozkręcenie” do struktury łańcucha polipeptydowego. W rezul-tacie, pojedyncze cząsteczki białek zawieszone są swobodnie w roztworze SDS. Ponadto, β-merkaptoetanol stosowany w tej procedurze jest związkiem o silnych właściwościach reduku-jących, przecina on mostki dwusiarczkowe (S-S) między białkami. W trakcie elektroforezy SDS-PAGE aniony SDS nie tylko denaturują białko, ale również opłaszczają polipeptydy w proporcji 1,4 μg SDS/1 μg białka. W rezultacie, każda cząsteczka białka wiąże dużą liczbę ujemnie naładowanych cząsteczek SDS, które pokonują wynikający ze składu aminokwasowego natywny ładunek białka. Bez tego etapu elektroforeza białek nie byłaby możliwa. W polu elektrycznym ujemnie naładowane białka migrują w kierunku dodatniej elektrody.

W celu wzmocnienia rozdziału białek sto-suje się żele poliakryloamidowe. Żel poliakryloami-dowy (PAA) uzyskuje się poprzez wspólną polime-ryzację akryloamidu i N,N’-metylenobisakrylo-amidu (bisakryloamidu), od ilości tego ostatniego zależy usieciowanie żelu. Mechanizm polimeryzacji katalizowany jest przez wolne rodniki, których źró-dłem jest nadsiarczan amonu, a ich uwalnianie przy-spiesza dodatek N,N,N’,N’-Tetramethylethylene-diaminy (TEMED). Stężenie żelu PAA decyduje o rozdziale białek. Według ogólnie przyjętej za-sady, im większe białko chcemy oznaczyć, tym niższe stężenie żelu powinno być użyte. Ma to decydujące znaczenie dla odczytu ostrości prąż-ków uzyskiwanych przy detekcji białka. W trak-cie elektroforezy SDS-PAGE białka o małej ma-sie cząsteczkowej migrują szybciej w porówna-niu do białek o dużej masie cząsteczkowej. Roz-dział prowadzi się w żelu składającym się z dwóch części, dolnej - tzw. żel rozdzielający i górnej - tzw. żel zagęszczający. Żele różnią się między sobą gęstością oraz odczynem pH. Białka, w buforze o niskim przewodnictwie (lo-ading buffer) nałożone w części zagęszczającej żelu, ulegają skoncentrowaniu na skutek obu-stronnego kontaktu z buforami o wysokim prze-wodnictwie, tj. w buforze elektrodowym oraz w buforze w żelu zagęszczającym. Białka ule-gają zagęszczeniu w wąskim regionie, powyżej granicy z żelem rozdzielającym. Dzięki takiemu umiejscowieniu możliwy jest następnie efek-tywny rozdział białek w części rozdzielającej żelu (Wu i in., 2004; Szalata i in., 2004; Kyhse-Anderson, 1984; Towbin i in., 1979).

Transfer białek z żelu na membranę

Przeniesienie białka z żelu na membranę następuje w drodze elektrotransferu. Odbywa się to w ten sposób, że ujemnie naładowane białka, migrując w kierunku dodatniej elektrody, zostają zatrzymane na membranie umieszczonej między żelem a anodą. Białka, w postaci prążków znaj-dujących się na różnych poziomach, są precyzyj-nie przeniesione na membranę dając lustrzany obraz rozdzielonych w żelu polipeptydów.

Transfer białek z żelu na membranę można wykonać przy użyciu kilku metod. Naj-prostszą z nich jest dyfuzja, inne metody to transfer w warunkach próżniowych i elektro-transfer. Transfer w warunkach próżniowych (vacuum blotting) wykonywany jest przy użyciu

niskiego ciśnienia od 200 do 400 Pa. Transfer trwa maksymalnie do 1 godz., a uzyskane prążki cechują się większą ostrością oraz rozdzielczo-ścią niż przy wykorzystaniu innych technik transferu. Pomimo tych zalet blottingu próżnio-wego, obecnie najczęściej stosowaną techniką jest elektrotransfer. Zaletą tej formy transferu jest szybkość, co znacznie redukuje dyfuzję sa-mych białek i pozwala na uzyskanie bardziej czytelnego obrazu po immunodetekcji. Elektro-transfer można przeprowadzić dwoma sposo-bami: jako elektrotransfer mokry, gdy „kanapkę transferową” zamoczymy w buforze do transferu, lub elektrotransfer półmokry, gdy „kanapka transferowa” umieszczona jest pomiędzy bibu-łami nasączonymi buforem (Wu i in., 2004; Kyhse-Anderson, 1984; Towbin i in., 1979).

Jako membranę w elektrotransferze naj-częściej stosuje się aktywowany nylon (PVDF, polivinylidene fluoride), można stosować również nitrocelulozę. Nitroceluloza jest tania, ma jednak pewne wady: jest stosunkowo krucha, zwłaszcza gdy jest sucha, a białka nie wiążą się z nią kowalencyjnie. Natomiast PVDF ma bardzo dobrą wytrzymałość mechaniczną, umożliwia wiązanie dużej liczby białek, a sygnał uzyskany w trakcie detekcji jest mocniejszy, przy równoczesnym ograniczeniu tła (Wu i in., 2004; Kyhse-Anderson, 1984; Towbin i in., 1979).

Inkubacja membrany ze specyficznym prze-ciwciałem

Western-blot wymaga stosowania specy-ficznych przeciwciał, które służą jako sondy. Specyficzność i aktywność przeciwciał to klu-czowe, lecz i newralgiczne warunki sukcesu metody. Przeważnie stosuje się dwa rodzaje przeciwciał: monoklonalne (mysie) i poliklo-nalne (królicze). Częściej używana jest surowica z przeciwciałami poliklonalnymi. Zawiera ona bowiem wiele przeciwciał, które wiążąc się z różnymi epitopami antygenu generują znacz-nie silniejszy sygnał niż można uzyskać przy użyciu przeciwciał monoklonalnych. Jednak, użycie surowicy z przeciwciałami poliklonal-nymi zwiększa ryzyko powstania dodatkowych, niespecyficznych sygnałów, gdyż do reakcji wprowadzane są również inne przeciwciała, obecne w organizmie osobnika użytego do im-munizacji. Dlatego, z uwagi na specyficzność reakcji, lepiej jest stosować przeciwciała mono-

klonalne, gdyż identyfikując określony antygen przyłączają się one tylko do jednego epitopu. Niestety, posiadają również pewne wady, a mia-nowicie nie reagują ze zdenaturowanymi biał-kami, zwykle rozpoznając epitopy powstałe wskutek zwinięcia III-rzędowej struktury białka. Należy mieć też na uwadze, że przeciwciała mo-noklonalne mogą również powodować powsta-wanie niespecyficznych sygnałów poprzez od-działywanie z podobnymi epitopami innych bia-łek (Wu i in., 2004).

Detekcja białek na membranie

Ostatnim etapem metody western-blot jest detekcja białek na membranie.

Przy detekcji najczęściej stosuje się przeciwciała tzw. II-rzędowe, ponieważ rozpo-znają one przeciwciała użyte do reakcji wiązania z antygenem. Przeciwciała użyte do reakcji z antygenem (czyli poszukiwanym białkiem) no-szą nazwę przeciwciał I-rzędowych. Przeciw-ciała II-rzędowe mogą być znakowane radioak-tywnie, najczęściej jednak skoniugowane są z enzymem, np. z peroksydazą chrzanową (HRP) lub fosfatazą alkaliczną (AP), co pozwala na przeprowadzenie reakcji barwnej.

W ostatnich latach coraz częściej stoso-wana jest chemiluminescencyjna metoda detekcji białek. Wykorzystuje ona I- lub II-rzędowe prze-ciwciała skoniugowane z enzymem HRP, który w reakcji z cyklicznymi diacylohydrazydami (np. luminolem) w środowisku zasadowym emituje promieniowanie. W wyniku oksydacji luminol przechodzi w stan wzbudzenia, a powracając do stanu podstawowego emituje promieniowanie świetlne. Wynik doświadczenia zarejestrowany zostaje na kliszy wrażliwej na niebieskie światło. Metoda ta charakteryzuje się następującymi za-letami:

• wysoka czułość (10 razy czulsza w sto-sunku do metod wykorzystujących zwykłe barwniki oraz 2-5 razy czulsza w stosunku do metod izotopowych);

• dobra rozdzielczość;

• znaczna szybkość;

• oszczędność dzięki stosowaniu małych ilości przeciwciał;

• możliwość przeprowadzenia powtórzeń detekcji na tej samej membranie.

·         Prąd elektryczny to ukierunkowany ruch ładunków elektrycznych w postaci np. elektronów czy jonów. Po przyłożeniu pola elektrycznego do mieszaniny cząstek naładowanych, zaczynają one się poruszać w uporządkowany sposób i tak powstaje prąd. W elektroforezie do roztworu cząsteczek, które mogą być nośnikami prądu (do tzw. elektrolitu albo buforu do elektroforezy) przykłada się „zwykły” prąd elektryczny z gniazdka. Przewody umieszcza się w pojemniku z elektrolitem w ten sposób, że po jednej stronie kabel wprowadza elektrony (elektrony są naładowane ujemnie), a z drugiej je „odbiera” (Rysunek 1). Kabel wprowadzający elektrony nazywamy katodą i oznaczamy jako „-”, natomiast kabel odbierający to anoda, czyli „+”.

Rysunek 1. Przepływ elektronów przez elektrolit

·         Jeśli w roztworze, przez który przepuszczamy prąd są cząsteczki naładowane ujemnie (tak jak elektrony), będą one poruszać się tak samo jak elektrony – od katody do anody. Cząsteczki naładowane dodatnio będą wędrowały w przeciwnym kierunku – od anody do katody. Szybkość ich ruchu będzie zależała od wielu czynników, np. natężenia przyłożonego prądu, ładunku i wielkości cząsteczek oraz tego, jak lepki jest roztwór, w którym znajdują się jony.

Co to ma wspólnego z biologią molekularną?

·         Biologia molekularna zajmuje się biologią na poziomie molekularnym, czyli cząsteczkowym. Główne cząsteczki występujące w organizmach to białka, kwasy nukleinowe i lipidy, czyli tłuszcze. Szczególne zainteresowanie naukowców budzą białka i kwasy nukleinowe (nie oznacza to, że lipidy są nieważne!). Kwasy nukleinowe (DNA, RNA) kodują białka, wśród białek zaś wyróżniamy m.in. enzymy i hormony, które decydują o budowie i funkcji organizmu (Rysunek 2).

Rysunek 2. Rola DNA i białek dla organizmu (rysunki z bazy danych PDB)

·         Aby zrozumieć istotę elektroforezy, przyjrzymy się teraz budowie białek i kwasów nukleinowych.

Białka

·         Białka są liniowymi, ale zwiniętymi w kłębek (Rysunek 2) cząsteczkami złożonymi z mniejszych podjednostek, aminokwasów, zwanych również resztami. Jest dwadzieścia różnych aminokwasów występujących w białkach. W jednym białku może być nawet około trzydziestu tysięcy aminokwasów (jak w ludzkiej tytynie – białku mięśni)! Niektóre z aminokwasów są naładowane w warunkach fizjologicznych (tzn. takich, jakie występują w organizmie): kwas asparaginowy i kwas glutaminowy są naładowane ujemnie, a lizyna, histydyna i arginina – dodatnio (Rysunek 3).

Rysunek 3. Reszty obdarzone ładunkiem w warunkach fizjologicznych (na czerwono zaznaczone ładunki)

·         Wypadkowy ładunek białka to suma ładunków dodatnich i ujemnych jego reszt. Jeśli np. białko posiada jedną resztę kwasu asparaginowego, jedną histydyny i dwie argininy, to jego wypadkowy ładunek w warunkach fizjologicznych wynosi -1 + 1 + 2 = +2, jest więc dodatni. Są też białka, których ładunek wynosi zero lub jest ujemny.

Kwasy nukleinowe

·         Kwasy nukleinowe, podobnie jak białka, są liniowe (Rysunek 2) i zbudowane z mniejszych podjednostek, tym razem nukleotydów. Jest generalnie kilka nukleotydów występujących w organizmach i mogą one tworzyć łańcuchy o długości dochodzącej do stu dwudziestu… miliardów nukleotydów (u rośliny – szachownicy)! W warunkach fizjologicznych nukleotydy, a więc również całe łańcuchy kwasów nukleinowych, posiadają ładunek ujemny (Rysunek 4).

Rysunek 4. Niektóre z nukleotydów(na czerwono zaznaczone ładunki w warunkach fizjologicznych)

·         Ponieważ zarówno białka, jak i kwasy nukleinowe są obdarzone ładunkiem, będą one poruszały się w polu elektrycznym. Szybkość tego ruchu będzie zależała od wypadkowego ładunku cząsteczki i jej wielkości. Cząsteczki bardziej naładowane poruszają się szybciej, tak samo jak cząsteczki mniejsze. Im cząsteczka większa lub mniej naładowana, tym wolniej się porusza. Może się zdarzyć tak, że cząsteczka jest bardzo naładowana i duża, wtedy będzie poruszała się tak samo, jak cząsteczka słabiej naładowana, ale mniejsza. Można powiedzieć, że szybkość ruchu zależy od stosunku ładunku do wielkości cząsteczki – im większy, tym ruch jest szybszy.

·         Trzeba jeszcze wspomnieć, że białka mogą wędrować zarówno do anody, jak i katody, gdyż mogą być naładowane ujemnie lub dodatnio, natomiast kwasy nukleinowe zawsze są naładowane ujemnie, więc wędrują tylko do anody.

Podział metod elektroforetycznych

·         Najogólniej można podzielić elektroforezę ze względu na środowisko, w którym poruszają się jony. Wyróżniamy wtedy:

o        elektroforezę swobodną

o        elektroforezę na nośnikach

...