Ocena toksykologiczna metod stosowanych w zatruciach środkami psychoaktywnymi.pdf

PRACE POGL¥DOWE REVIEW PAPERS

Roman WACHOWIAK

Ocena toksykologiczna metod

diagnostycznych stosowanych w zatruciach

rodkami psychoaktywnymi

Toxicological evaluation of diagnostic methods used in

intoxication with psychoactive substances

Katedra i Zak³ad Medycyny S¹dowej

Akademii Medycznej im. K. Marcinkowskiego

w Poznaniu

Kierownik:

Prof. dr hab. med. Zygmunt Przybylski

Diagnostyka toksykologiczna przy-

padków zatruæ zwi¹zkami psychoak-

tywnymi, notowanymi w toksykologii

klinicznej i s¹dowej wymaga odpo-

wiednich badañ laboratoryjnych. Pra-

ca dotyczy oceny aktualnie u¿ywanych

metod analizy jakociowo-ilociowej

badanych zwi¹zków psychoaktywnych

w materiale biologicznym. Przydatnoæ

najczêciej stosowanych metod skri-

ningowych (immunochemicznych) i

potwierdzaj¹cych (fizykochemicznych)

oceniono w aspekcie kryteriów wali-

dacyjnych, dotycz¹cych specyficzno-

ci limitu detekcji i oznaczalnoci.

Toxicological diagnosis in cases of

intoxication with psychoactive sub-

stances known in clinical and foren-

sic toxicology requires appropriate

laboratory studies. The paper pertains

evaluation of the currently employed

techniques of quantitative and quali-

tative analysis of psychoactive sub-

stances in a biological material. Use-

fulness of the most frequently applied

screening (immunochemical) ap-

proaches and the confirmation (physi-

cochemical) techniques was evaluated

against the validation criteria, relating

to the specificity, detection limit and

sensitivity of the discussed sub-

stances.

Dodatkowe s³owa kluczowe:

metody analityczne

analiza zwi¹zków psychoaktywnych

zatrucia

oceny

Additional key words:

analytical techniques

psychoactive drug testing

intoxication

evaluation

Adres do korespondencji:

Prof. dr hab. farm. Roman Wachowiak

Katedra i Zak³ad Medycyny S¹dowej

Akademii Medycznej

ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ, POLAND

Tel./Fax: (61) 869-91-81 w. 551

e-mail: ZMS@eucalyptus.usoms.poznan.pl

Wprowadzenie

Diagnostyka toksykologiczna przypad-

ków zatruæ miertelnych, obok monitoringu

kontrolowanej terapii przedawkowania le-

ków (overdose drug monitoring) odgrywa

aktualnie wa¿n¹ rolê w nowoczesnej toksy-

kologii klinicznej i s¹dowej. Zapotrzebowa-

nie na tego typu badania ci¹gle wzrasta,

bowiem s¹ ono determinowane czêstotliwo-

ci¹ zatruæ zwi¹zanych z systematycznym

nadu¿ywaniem leków, w tym rodków psy-

choaktywnych. Motywacja i celowoæ ozna-

czania poziomów leków i ich metabolitów w

p³ynach ustrojowych w przypadku zatruæ

stanowi podstawê racjonalnego dzia³ania

terapeutycznego, a szczególnie detoksyka-

cyjnego. Koniecznoæ okrelenia poziomu

ksenobiotyku w p³ynach ustrojowych i tkan-

kach ma szczególne znaczenie w toksyko-

logii s¹dowej, bowiem wielokrotnie w spo-

sób obiektywny pozwala ustaliæ przyczynê i

mechanizm zgonu. Szczególne zapotrzebo-

wanie diagnostyczne dotyczy równie¿ inter-

pretacji wielu przypadków medyczno-s¹do-

wych czy klinicznych, okrelonych jako trud-

ne, z racji m.in. nieprzytomnego stanu pa-

cjenta, przy braku jakichkolwiek informacji

dotycz¹cych okolicznoci zdarzenia. Ko-

niecznoæ indywidualizacji w odniesieniu do

poszczególnych stanów zatruæ pacjentów

leczonych w oddzia³ach toksykologii klinicz-

nej, wymaga specjalistycznych oznaczeñ

poziomów leków w osoczu z czêstotliwoci¹

adekwatn¹ do istniej¹cych zagro¿eñ, wyni-

kaj¹cych z obserwacji klinicznych. Propo-

nowane metody analityczne, przeznaczone

do rutynowych oznaczeñ, powinny byæ wy-

starczaj¹co czu³e, bardzo selektywne, aby

w sposób obiektywny mog³y wykazaæ zale¿-

noæ pomiêdzy poziomem leku w osoczu, a

efektem notowanych oddzia³ywañ toksyko-

dynamicznych. Powszechnoæ stosowania

szybkich i wiarygodnych metod analizy ja-

kociowo-ilociowej ksenobiotyków w p³y-

nach ustrojowych jest uzale¿niona od po-

stêpu technicznego, który w ostatnim okre-

sie jest wyranie zauwa¿alny. Koszty zwi¹-

zane z zakupem odpowiedniego wyposa¿e-

nia aparaturowego i niezbêdnych odczyn-

ników, przy obecnych mo¿liwociach finan-

sowych wskazuj¹ na zasadnoæ centraliza-

cji us³ug diagnostycznych u³atwiaj¹cych

szybkie, kompleksowe badanie.

Aktualnie istnieje zwiêkszone zapotrze-

bowanie w zakresie toksykologicznych ba-

dañ diagnostycznych, klinicznych, jak i s¹-

dowych, wynikaj¹ce z potencjalnego zagro-

¿enia zwi¹zanego z dystrybucj¹ i nadu¿y-

waniem leków psychoaktywnych i realizacji

za³o¿eñ Ustawy o zapobieganiu narkoma-

nii. Potwierdzeniem tych obserwacji jest

wzrost doniesieñ kazuistycznych, dotycz¹-

cych ostrych zatruæ i zgonów.

Maj¹c na uwadze koniecznoæ wykony-

wania odpowiednich badañ diagnostycz-

nych, niezbêdnych w kompleksowej moni-

torowanej terapii zatruæ, przedstawiono tren-

dy i mo¿liwoci analityczne, warunkuj¹ce

obiektywn¹ interpretacjê istniej¹cych zale¿-

noci, w aspekcie wybranych zwi¹zków psy-

choaktywnych.

Wyniki badañ diagnostycznych

a uwarunkowania interpretacyjne

W rozwa¿aniach dotycz¹cych u¿ywania

rodków psychoaktywnych (odurzaj¹cych,

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

215

narkotycznych), nale¿y uwzglêdniæ cztery

dominuj¹ce grupy zwi¹zków chemicznych

wykazuj¹cych efekt oddzia³ywañ na orod-

kowy uk³ad nerwowy. Wskazaæ tutaj nale¿y

na nastêpuj¹ce grupy zwi¹zków:

narkotyczne zwi¹zki przeciwbólowe

(morfina, heroina, kodeina) i syntetyczne

analogi, np. (metadon, dolargan);

zwi¹zki dzia³aj¹ce depresyjnie na

orodkowy uk³ad nerwowy (barbiturany, ben-

zodiazepiny, tricykliczne antydepresanty,

kwas gamma hydroksymas³owy [GHB]);

psychostymulanty (amfetamina, ko-

kaina, efedryna, kofeina);

zwi¹zki halucynogenne (LSD, me-

skalina, ecstasy, psylocybina, kwas ibote-

nowy).

Powy¿szy podzia³ systemowy rodków

psychoaktywnych zosta³ rozbudowany w

oparciu o raport Komitetu Ekspertów WHO.

Wyró¿niono w nim 8 grup zwi¹zków, które

w aspekcie oddzia³ywañ farmakologicznych

mieszcz¹ siê w wymienionym wykazie czte-

rogrupowym. Wysoka aktywnoæ farmako-

logiczna rodków psychoaktywnych, deter-

minowana niskimi dawkami ich za¿ywania,

przy równoczenie niekorzystnym wspó³-

czynniku terapeutycznym (rozpiêtoæ miê-

dzy dawk¹ lecznicz¹ a mierteln¹), stwarza

trudny uk³ad analityczny, zwi¹zany z wyj¹t-

kowo niskimi zakresami stê¿eñ w p³ynach

ustrojowych (10 -6 -10 -12 g/ml). Zakresy ozna-

czalnoci uzyskane najczêciej stosowany-

mi metodami przedstawiono na rycinie 1.

W ocenie zale¿noci przyczynowo-skut-

kowej, obowi¹zuj¹ce miêdzynarodowe nor-

my interpretacyjne zakresów stê¿eñ tera-

peutycznych, toksycznych i miertelnych,

dotycz¹ wy³¹cznie krwi, jako bardziej stabil-

nego objêtociowo uk³adu odniesienia w

porównaniu z moczem. Poziomy stê¿eñ

najczêciej notowanych rodków psychoak-

tywnych oraz okresy ich biologicznego pó³-

trwania w organizmie cz³owieka, s¹ dostêp-

ne w wielu monografiach [4,8,9,13,26], czy

programach np. TOXINET (Internet), czy

MICROMEDEX (INFO TECHNOLOGY Sup-

plied Ltd.).

Wa¿nym elementem niezbêdnym w

kompleksowej ocenie analizowanych zale¿-

noci toksykodynamicznych ksenobiotyku

jest koniecznoæ uwzglêdnienia (udzia³u)

metabolitów produktów ich biochemicz-

nych przekszta³ceñ. Metabolity, obok zwi¹z-

ków macierzystych, mog¹ interferowaæ za-

równo w zakresie oddzia³ywañ toksykody-

namicznych, jak równie¿ uzyskiwanego wy-

niku badañ analitycznych. Klasyczny przy-

k³ad synergistycznego oddzia³ywania karba-

mazepiny i jej aktywnego metabolitu 10,11-

epoksydu, czy oddzia³ywañ nordiazepamu,

metabolitu jego prekursorów klorazepatu,

diazepamu, chlorodiazepoksydu, jest po-

wszechnie znany [8,9,13,29]. W³aciwa in-

terpretacja istniej¹cych oddzia³ywañ toksy-

kodynamicznych dla tych uk³adów jest mo¿-

liwa po uprzedniej selektywnej identyfikacji

i ró¿nicuj¹cej analizie ilociowej poszczegól-

nych komponentów zawartych w p³ynach

ustrojowych. Wyniki badañ laboratoryjnych

uzyskane niespecyficznymi i tym samym

niew³aciwymi metodami analitycznymi nie

pozwalaj¹ na obiektywn¹ interpretacjê ob-

jawów klinicznych. Mo¿liwoæ równoczesne-

go okrelenia poziomów zwi¹zku macierzy-

Rycina 1

Metody i zakresy najczêciej notowanych oznaczalnoci zwi¹zków psychoaktywnych w p³ynach ustrojowych.

Methods and ranges of detection for psychoactive drugs in body fluids.

stego i jego aktywnego metabolitu we krwi

przy ich zró¿nicowanych parametrach far-

makokinetycznych (szybkoæ eliminacji,

czas biologicznego pó³trwania, klirens), po-

zwala wyjaniæ nietypowy przebieg klinicz-

ny zatrucia. Krytyczna ocena powinna do-

tyczyæ zawsze wyników badañ uzyskanych

niespecyficznymi metodami, np. metody

immunochemiczne mog¹ byæ sum¹ oddzia-

³ywañ interferuj¹cych pochodnych o podob-

nym uk³adzie strukturalnym, (reaktywnoæ

krzy¿owa cross-reactivity). Z tego te¿

wzglêdu dla danego testu oznaczanych kse-

nobiotyków uwzglêdnia siê reaktywnoæ

krzy¿ow¹, która okrela iloæ wybranego

zwi¹zku interferuj¹cego, wywo³uj¹cego w

uk³adzie analitycznym tak¹ sam¹ wartoæ

parametru pomiarowego (absorbancja), jak

wybrane stê¿enie odpowiedniego wzorca,

np. 100 mg/ml nordiazepamu w tecie na

obecnoæ benzodiazepin. Uzyskany wiêc

pozytywny wynik badañ immunochemicz-

nych, przy braku informacji o innych za¿y-

wanych lekach przez pacjenta, wymaga

odpowiedniej interpretacji o istniej¹cych za-

k³óceniach z mo¿liwoci¹ wyst¹pienia wy-

niku fa³szywie pozytywnego. Przyk³adowo

fa³szywie pozytywny wynik badañ, potwier-

dzaj¹cy obecnoæ tricyklicznych antyde-

presantów jest czêsto obserwowany dla

przypadków zatruæ wy³¹cznie karbamaze-

pin¹ podczas jej równoczesnej analizy

metod¹ TDx.

Z tego te¿ wzglêdu handlowa propozy-

cja wielu producentów zestawów analitycz-

nych ostrzega i okrela prawdopodobieñ-

stwo wystêpowania reaktywnoci krzy¿owej

wskazuj¹c na ich ograniczon¹ pewnoæ i

skutecznoæ analityczn¹. Powy¿sze niedo-

godnoci sprawiaj¹, ¿e pozytywny test ba-

dañ jakociowych, a nawet ilociowych, uzy-

skany metodami homogenicznymi-immuno-

chemicznymi wymaga zawsze dodatkowo

potwierdzenia innymi metodami fizykoche-

micznymi.

Diagnostyka toksykologiczna zatruæ

rodkami psychoaktywnymi opiera siê

przede wszystkim na analizie chemicznej

materia³u biologicznego (krew, mocz, lina,

w³osy) - zatrucia kliniczne, poszerzone do-

datkowo o tkanki (zatrucia miertelne). Sze-

reg uwarunkowañ sprawia, ¿e mocz okazu-

je siê wa¿nym materia³em biologicznym

przydatnym w diagnostyce toksykologicznej

[8,28].

Wiêkszoæ dostêpnych skriningowych

metod diagnostycznych rodków psychoak-

tywnych dotyczy wiêc ich analizy w moczu

[DAU-test Drug of abuse urine]. Za u¿y-

ciem moczu jako preferencyjnego materia-

³u biologicznego przemawia szereg uwarun-

kowañ, wród których mo¿na wymieniæ:

d³u¿szy czas przebywania ksenobio-

tyków w moczu ani¿eli we krwi, stê¿enie we

krwi jest ograniczone czasem pó³trwania

(t 1/2 );

wy¿sze poziomy stê¿eñ w moczu w

porównaniu z krwi¹ (LSD jest typowym przy-

k³adem);

nieinwazyjny sposób pobierania pró-

bek moczu do badañ.

W ostatnich latach zwrócono uwagê na

mo¿liwoæ wykorzystania w³osów osoby

podejrzanej o d³u¿sze nadu¿ywanie leków,

w tym narkotyków jako w³aciwego mate-

ria³u dowodowego. Badania lat 90-tych

wskazuj¹ jednoznacznie, ¿e wiêkszoæ nad-

u¿ywanych zwi¹zków psychoaktywnych,

takich jak kokaina, heroina, amfetamina,

metadon, mog¹ byæ wykryte i oznaczone ilo-

ciowo we w³osach [14]. Kontrola przestrze-

gania okresu abstynencji w czasie leczenia

odwykowego, czy te¿ jej dorane przepro-

wadzenie w przypadku podejrzeñ o za¿y-

216

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

R. Wachowiak

wanie rodka psychoaktywnego jest deter-

minowana okresem biologicznego pó³trwa-

nia, tj. czasokresem przebywania zwi¹zków

narkotycznych w p³ynach ustrojowych. Za-

bezpieczenie wiêc najczêciej spotykanego

materia³u (krew, mocz) po okresie ukoñczo-

nej eliminacji narkotyku z organizmu nie

pozwala na obiektywn¹ ocenê potwierdza-

j¹c¹ za¿ycie, czy te¿ uzale¿nienie.

nym skriningu toksykologicznym rodków

psychoaktywnych spowodowa³o wprowa-

dzenie przez firmê Merck zestawów anali-

tycznych TRIAGE. Zaproponowany system

pozwala dokonaæ szybkiej zró¿nicowanej

analizy jakociowej moczu, w kierunku sied-

miu (TM-7) czy omiu (TM-8) podstawowych

grup rodków psychoaktywnych Metadon

(MTD), benzodiazepiny (BZO), kokaina

(COC), amfetamina (AMT), kannabinole

(THC), alkaloidy grupy opium (OPI), barbi-

turany (BAR) i tricykliczne antydepresanty

(TCA).

Istot¹ dzia³ania testu jest konkurencyj-

na reakcja zwi¹zku psychoaktywnego za-

wartego w moczu z jego chemicznie znako-

wanym po³¹czeniem z koloidalnym z³otem

(koningat) o okrelon¹ liczbê miejsc prze-

ciwcia³a umieszczonego na pasku membra-

nowym w tzw. strefie testowej p³ytki. W koñ-

cowym etapie pomiaru trwaj¹cym ok. 3-8

minut barwny pr¹¿ek w strefie testowej jest

obserwowany wówczas, gdy w badanym

moczu nie wystêpuje poszukiwany kseno-

biotyk (próba ujemna). Brak pr¹¿ka barw-

nego w strefie testowej potwierdza obecnoæ

ksenobiotyku w próbie badanej (wynik do-

datni).

W rutynowych badaniach skriningo-

wych, obok systemu TRIAGE, u¿ywane s¹

bardzo czêsto jednostopniowe testy immu-

nochemiczne ukierunkowane na dan¹ gru-

pê zwi¹zków psychoaktywnych. Na rynku

dominuj¹ testy firm HUMAN, HYDREX, IN-

TIMEX, SYVA BEHRING.

Ostatnia pozycja firmy SYVA BEHRING

i Roche Diagnostic dotyczy jednostopniowe-

go testera kasetowego (SYVA-RADIO

TEST), kubkowego (SYVA-RAPID) oraz

ONTRAK TESTSTIK czy ONTRAK Test cup-

5, pozwalaj¹cego na równoczesn¹ identyfi-

kacjê pochodnych siedmiu lub piêciu grup

rodków psychoaktywnych (amfetaminy,

barbiturany, benzodiazepiny, kannabinole,

kokaina, metamfetamina, opiaty, fencyklidy-

na oraz tricykliczne antydepresanty).

(solid phase enzyme immunoassay).

Zasada metody EMIT proponowanej

przez SYVA CORPORATION oparta jest na

fakcie hamowania aktywnoci enzymu w

uk³adzie konkurencyjnego wi¹zania przeciw-

cia³a, np. wolnego leku zawartego w prób-

ce z lekiem znakowanym enzymem. Wolny

lek konkuruje z lekiem znakowanym enzy-

mem o po³¹czenia z przeciwcia³ami a ak-

tywnoæ enzymu jest wprost proporcjonal-

ne do iloci wolnego leku w próbce. Aktyw-

noæ enzymu nie zwi¹zanego z przeciwcia-

³ami (najczêciej bakteryjna dehydrogena-

za glukozo-6 fosforanowa) mierzona reduk-

cj¹ substratu NADP do NADPH jest deter-

minowana porednio stê¿eniem oznaczane-

go leku Ab=f (c) stê¿enie przy l = 340 nm.

Druga metoda homogeniczno-immunolo-

giczno-fluorescencyjno-polaryzacyjna

(FPIA) pozwala na okrelenie poziomów

wybranych zwi¹zków w osoczu, surowicy

czy moczu. W uk³adzie analitycznym wystê-

puje przeciwcia³o przeciw zwi¹zkowi ozna-

czonemu, zwi¹zek oznaczony po³¹czony z

barwnikiem fluorescencyjnym (znakowany

hapten), próbka badana, w której oznaczo-

ny jest zwi¹zek (nieznakowany hapten w

roztworze buforu rozcieñczonego). W te-

stach FPIA mierzona jest emisja wiat³a spo-

laryzowanego po uprzedniej kompetycyjnej

reakcji znakowanego i nieznakowanego

haptenu o miejsca wi¹zania w przeciwcia-

³ach. Automatyczny uk³ad rejestruj¹cy okre-

la stopieñ depolaryzacji wiat³a, który jest

odwrotnie proporcjonalny do wielkoci cz¹-

steczek rotuj¹cych. Stopieñ depolaryzacji

promieniowania fluoroscencyjnego jest

wprost proporcjonalny do stê¿enia leku w

próbce biologicznej. Metoda ta jest ca³ko-

wicie zautomatyzowana i z tego wzglêdu

czêciej stosowana w porównaniu z inny-

mi. Obie metody charakteryzuj¹ siê wyso-

k¹ oznaczalnoci¹ i dyskusyjn¹ specyficz-

noci¹ nie pozwalaj¹c¹ ustaliæ udzia³u po-

szczególnych pochodnych tworz¹cych dan¹

grupê. Przyk³adowo wszystkie pochodne

benzodiazepiny s¹ mniej lub bardziej czyn-

ne w tecie immunologicznym, a uzyskiwa-

ny wynik badania jest sum¹ oddzia³ywañ w

przeliczeniu na wybran¹ pochodn¹ tzw. ka-

libratora, np. nordiazepamu. W uk³adzie

oddzia³ywañ interferencyjnych nie rzadko

mo¿e wyst¹piæ interakcja zak³ócaj¹ca przez

inn¹ strukturalnie grupê chemiczn¹ zwi¹z-

ków.

Homogeniczne metody analityczne

stosowne w diagnostyce zatruæ

Najbardziej przydatnymi metodami ana-

lizy jakociowo-ilociowej ksenobiotyków,

stosowanymi w laboratoriach toksykologii

klinicznej i s¹dowej (szybki skrining), s¹ te

które nie wymagaj¹ odrêbnych technik izo-

lacji z materia³u biologicznego (krew, mocz,

lina). Stosowane w tym wzglêdzie metody

homogeniczne oparte s¹ przede wszystkim

na badaniach immunochemicznych. Mo¿li-

woæ wytwarzania przeciwcia³ dowolnych

leków w organizmie ¿ywym spowodowa³a

istotny postêp w badaniach jakociowo-ilo-

ciowych ksenobiotyków, a szczególnie

rodków psychoaktywnych. Standardowy

proces otrzymywania trwa³ych po³¹czeñ

chemicznych lek-bia³ko, opiera siê na wy-

korzystaniu reaktywnych grup (karboksyko-

wych, aminowych, tiolowych, hydroksylo-

wych), które z wybranym lekiem tworz¹

czynny zwi¹zek immunologiczny wysoko-

cz¹steczkowy hapten (immunogenic conju-

gate). Przyk³adowo, produkt po³¹czenia bia³-

ka z morfin¹ nastêpuje poprzez grupy hy-

droksylowe przy C-3 i C-6 lub heterocyklicz-

ny atom azotu tworz¹c hapten o ukierunko-

wanej zdolnoci wytwarzania przeciwcia³ w

odniesieniu do morfiny, kodeiny czy teba-

iny. Podanie haptenu drog¹ parenteraln¹

zwierzêtom dowiadczalnym stymuluje wy-

tworzenie wysoce specyficznych przeciwcia³

monoklonalnych, które po odpowiednim

mianowaniu mog¹ byæ wykorzystane w ana-

lizie jakociowo-ilociowej danego ksenobio-

tyku [25].

Jakociowa i pó³ilociowa ocena

toksykologiczna

Istotnym postêpem w szybkim skrinin-

gu toksykologicznym rodków psychoaktyw-

nych jest u¿ycie czu³ych testów p³ytkowych,

których rozwój chronologicznie zapocz¹tko-

wa³ Abuscreen ONTRAKT firmy Roche Dia-

gnostics (test aglutynacyjny) [2]. Zasada

oznaczania testem ONTRAKT sprowadza

siê do potwierdzenia, wzglêdnie wyklucze-

nia aglutynacji uk³adu konkurencyjnej reak-

cji ksenobiotyku zawartego w badanym

materiale (mocz) i osadzonym na tzw. LA-

TEXIE z przeciwcia³ami przeciw oznacza-

nemu zwi¹zkowi. U¿ycie testu ONTRAKT

wymaga zakupu odpowiednich zestawów

np. dla wybranych grup zwi¹zków psycho-

aktywnych. Wykrywalnoæ poszczególnych

ksenobiotyków w materiale biologicznym

jest zró¿nicowana, a o jej wymiarze decy-

duje wartoæ stê¿enia progowego (cutoff),

powy¿ej którego odczyt nale¿y uznaæ za

pozytywny. Progowe wartoci stê¿enia cut-

off dla wybranych oznaczeñ grup zwi¹zków

w odniesieniu do wybranej substancji kali-

bracyjnych oscyluj¹ w zakresie 25-1000 ng/

ml.

Metody immunochemiczne

stosowane w analizie ilociowej

zwi¹zków psychoaktywnych

Konsekwencj¹ rozszerzenia zakresu

u¿ycia jakociowych metod immunoche-

micznych by³o ich przystosowanie dla ce-

lów analiz ilociowej. Metody immunoche-

miczne nale¿¹ obecnie do najczêciej sto-

sowanych technik homogenicznych i nie

wymagaj¹cych wstêpnej izolacji moczu czy

osocza. Mniejsze zainteresowanie dotyczy

metod radioimmunologicznych (RIA) i radio-

receptorowych (RRA), które obok koniecz-

noci etapu rozdzia³u (metody heterogenicz-

ne) wymagaj¹ wzorca zwi¹zku znakowane-

go izotopem oraz odpowiedniego wyposa-

¿enia z racji u¿ycia izotopów promieniotwór-

czych.

Powszechnie stosuje siê dwie metody

homogeniczne, tj. enzymatyczno-immuno-

logiczn¹ (Enzyme-Multiplied Immunoasay

Technique EMIT-SYVA) oraz immunolo-

giczn¹ metodê fluoroscencyjno-polaryzacyj-

n¹ FPIA, TDx firmy ABBOT. Mniejsze za-

stosowanie znajduje heterogeniczna tech-

nika immunoenzymatyczna ELISA (enzyme-

linked-immunosorbent assays) w uk³adzie

analitycznym enzymu osadzonego na fazie

Metody heterogeniczne

potwierdzaj¹ce skriningowe wyniki

badañ immunochemicznych

Zastosowanie metod potwierdzaj¹cych

(confirmation) jest bardziej czasoch³onne i

wymaga zawsze zastosowania wstêpnej

izolacji z materia³u biologicznego. Wartoæ

u¿ytkowa nowoczesnych metod analizy ja-

kociowo-ilociowej ksenobiotyków w ma-

teriale biologicznym zale¿y wiêc przede

wszystkim od wydajnoci stosowanych me-

tod izolacji. Wród preferowanych technik

izolacji nale¿y wymieniæ klasyczn¹ ekstrak-

cjê typu ciecz/ciecz oraz znacznie szybsz¹

i bardziej wydajn¹ z u¿yciem fazy sta³ej (so-

lid phase extraction SPE) [1,22]. Wydaj-

ny proces izolacji klasycznej ksenobiotyku

z osocza czy moczu, po uprzednim jego

uwolnieniu z po³¹czeñ bia³ka czy koniugatu

Istotny postêp w szybkim zró¿nicowa-

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

217

II-ej fazy metabolizacji enzymatycznej, mo¿e

byæ osi¹gniêty wy³¹cznie w warunkach w³a-

ciwego doboru pH, uwarunkowanego cha-

rakterem kwasowo-zasadowego analitu.

Znajomoæ wartoci pka ksenobiotyku (war-

toæ pH, przy którym 50% zwi¹zku znajduje

siê w postaci zjonizowanej) jest w tym przy-

padku najwa¿niejszym parametrem odnie-

sienia. Przyk³adowo izolacja amfetaminy

(pka 9.9) wymaga rodowiska o pH powy-

¿ej 11, przy którym 100% jej postaci bêdzie

woln¹ zasad¹ podatn¹ do ekstrakcji roz-

puszczalnikami organicznymi.

Efektywny, a zarazem uproszczony i

szybki proces izolacji ksenobiotyków z oso-

cza, mo¿na uzyskaæ wykorzystuj¹c depro-

tonizuj¹ce w³aciwoci acetonitrylu w uk³a-

dzie 1:1. Oddzielony supernatat od precy-

pitatu bia³kowego, po uprzednim wyparowa-

niu i odpowiednim rozcieñczeniu, umo¿liwia

szybk¹ analizê w uk³adach analitycznych

(HPLC, GC). Znacznie przyspieszon¹ pro-

cedurê izolacji rodków psychoaktywnych

z materia³u biologicznego zapewnia ekstrak-

cja z u¿yciem faz sta³ych. Dyskutowane fazy

s¹ zmodyfikowanymi chemicznie postacia-

mi ¿elu krzemionkowego (zawieraj¹ m.in.

podstawione ³añcuchy wêglowodorów C 8 ,

C 18 ), czêsto z dodatkowymi podstawnika-

mi odpowiedzialnymi za polarnoæ adsor-

benta. U¿ywane najczêciej w krajowych

laboratoriach fazy sta³e s¹ produkowane

przez firmy J.T. Baker, Supelco, Varian, z

ukierunkowanym przeznaczeniem do izola-

cji zró¿nicowanych chemicznie grup rod-

ków psychotropowych. Koniecznoæ uzyski-

wania wyniku badañ w mo¿liwie jak najkrót-

szym czasie sprawia, ¿e aktualne trendy i

zapotrzebowania lansuj¹ szybkie metody

izolacji g³ównie z u¿yciem faz sta³ych nie

wymagaj¹cych wstêpnych etapów przygo-

towawczych (kondycjonowanie, aktywacja).

Powy¿sze oczekiwania spe³nia propozycja

firmy Varian dotycz¹ u¿ycia fazy sta³ej Ab-

selut Nexus. Procedura wykonawcza szyb-

kiej izolacji z wysok¹ wydajnoci¹ w zakre-

sie 80-100% sprowadza siê do trzyetapo-

wego prostego postêpowania w kolejnoci:

adsorbcja analitu z osocza, p³ukania wod¹ i

desorbcji metanolem. Uproszczone postê-

powanie ma zasadnicz¹ przewagê nad in-

nymi bardziej restrykcyjnymi i czasoch³on-

nymi. W praktyce, obok wymienionych faz

octyl -C 8 , octaldecyl C 18 , Narc-2 (Becker)

w rutynowych badaniach w toksykologii s¹-

dowej szersze zastosowanie znajduje Extre-

lut (Merck) jako uniwersalny sorbent zwi¹z-

ków o zró¿nicowanym charakterze kwaso-

wo-zasadowym i obojêtnym [7,11].

Wspó³czesna toksykologia kliniczna czy

s¹dowa, dysponuj¹ca nowoczesnymi tech-

nikami wykrywania trucizn musi dokonaæ ich

szybkiej i pewnej identyfikacji w materiale

biologicznym na drodze trudnej i skompli-

kowanej eliminacji co najmniej kilku tysiêcy

zwi¹zków chemicznych towarzysz¹cych

¿yciu cz³owieka. Zagadnienia zwi¹zane z

szybk¹ identyfikacj¹ ksenobiotyków w ma-

teriale biologicznym dotycz¹ ci¹g³ego roz-

wijania ró¿nych metod fizykochemicznych,

tworz¹c coraz bardziej doskona³e programy

tzw. systematycznej analizy toksykologicz-

nej. W celu wyeliminowania wielu czynni-

ków zak³ócaj¹cych powtarzalnoæ miêdzy-

laboratoryjn¹, w rutynowych badaniach tok-

sykologicznych stosuje siê korekcje para-

metrów identyfikacyjnych dla najczêciej

stosowanych metod chromatograficznych.

Zast¹pienie przez Kovatsa [15] parametru

czasu retencji stabilnym uk³adem odniesie-

nia indeksem retencji, da³o pocz¹tek no-

wym technikom identyfikacji zwi¹zków pro-

ponowanym przez Mofota i wspó³pracowni-

ków [1,19,20]. Podobne zasady systema-

tycznej analizy identyfikacyjnej, opartej na

bazie indeksów retencji, zaproponowano dla

metody chromatografii cieczowej HPLC

[3,5,12,17]. Chromatografia cieczowa nale-

¿y aktualnie do najbardziej przydatnych i

efektywnych metod analizy jakociowo-ilo-

ciowej ksenobiotyków w materiale biolo-

gicznym. Jej zastosowanie dla celów iden-

tyfikacyjnych znacznie wzros³o po wprowa-

dzeniu nowej techniki detekcji typu DIODE-

ARRAY. Zastosowanie tego typu detekcji

pozwala uzyskaæ obok sygna³u piku dane-

go zwi¹zku na chromatogramie jego widmo

UV (200-350 nm) w uk³adzie trójwymiaro-

wym, potwierdzaj¹c¹ jego jednorodnoæ. Ta

w³aciwoæ detektora DIODE-ARRAY pod-

nosi znacz¹co mo¿liwoci identyfikacji

zwi¹zków [6,11,16,18,23,24].

Komputerowe sterowanie uk³adu HPLC

zawieraj¹cego dodatkowo bank widm w

nadfiolecie, umo¿liwia szybk¹ identyfikacjê

dowolne zarejestrowanego piku badanego

zwi¹zku. Aktualnie istniej¹ gotowe progra-

my komputerowe pozwalaj¹ce na podsta-

wie banku widm (library search) dokonaæ

identyfikacji zwi¹zku ujêtego w rejestrze

danych. Wród dostêpnych programów

uwagê zwraca propozycja handlowa firmy

Hewlett Packard aktualny dystrybutor w

Polsce - AGILENT TECHNOLOGY, dotycz¹-

ca programu obejmuj¹cego identyfikacjê

ponad 1600 zwi¹zków (g³ównie leków i ich

metabolitów oraz pestycydów i innych), w

uk³adzie 12-blokowego podzia³u (sublibra-

ries). Niezast¹pion¹ metodê identyfikacji i

analizy ilociowej zwi¹zków psychoaktyw-

nych jest metoda chromatografii gazowej i

spektrofotometrii masowej (GC/MS) z rów-

noczesn¹ mo¿liwoci¹ korzystania z biblio-

teki widm masowych np. systemu HP 5997

OC MS/MD Chemistation. Wród mo¿liwych

technik analitycznych w tym uk³adzie, za-

stosowanie znalaz³a technika pe³nego wid-

ma masowego (MID - multiple ion detection)

stosowanego dla wy¿szych stê¿eñ bada-

nych zwi¹zków. Dla przypadków ni¿szych

stê¿eñ ksenobiotyków typowych dla mate-

ria³u biologicznego zastosowanie znajduje

technika SIR (selected ion recording) czy

SIM (selected ion monitoring). Obie techni-

ki pozwalaj¹ na monitorowanie zmian inten-

sywnoci wybranych specyficznych frag-

mentów cz¹steczki tworz¹cych widmo ma-

sowe. Uzyskane dane dla materia³u bada-

nego przy u¿yciu dowolnej techniki, mog¹

znaleæ potwierdzenie w komputerowym

uk³adzie porównawczym z odpowiednim

wzorcem wybranym z banku widm. Metoda

GC/MS znajduje równie¿ zastosowanie w

analizie ilociowej [21,30]. Rutynowo, z uwa-

gi na oznaczalnoæ, stosuje siê technikê SIM

z równoczesnym u¿yciem wzorca wewnêtrz-

nego, którym jest pochodna deuterowana

oznaczonego zwi¹zku. Kalibracja dotyczy

poredniej zale¿noci funkcji zró¿nicowa-

nych stê¿eñ zwi¹zku oznaczonego, wyra-

¿onego stosunkiem intensywnoci wybrane-

go z widma jonu w odniesieniu do intensyw-

noci okrelonego jonu pochodnej determi-

nowanej, dodanej w sta³ym stê¿eniu do roz-

tworów wzorcowych.

Niezast¹pion¹ metod¹ stosowan¹ w tok-

sykologii s¹dowej i klinicznej jest chromato-

grafia gazowa z mo¿liwoci¹ u¿ycia innych

detektorów ani¿eli masowy. Zastosowanie

uk³adu GLC z odpowiednim detektorem

(ECD, NPD, AFID, FID, TCD) pozwala re-

gulowaæ nie tylko oznaczalnoæ ksenobio-

tyków, ale równie¿ zapewnia eliminacjê

mo¿liwych wp³ywów interferuj¹cych, np.

pochodz¹cych od u¿ytego rozpuszczalnika.

Ró¿norodnoæ rozwi¹zañ technicznych,

mo¿liwoæ wyboru odpowiednich technik

analitycznych, analiza ksenobiotyków jako

pochodnych sililowych, acetylowych, alkilo-

wych, estrowych, eliminacja t³a interferuj¹-

cych zanieczyszczeñ, predystynuj¹ chroma-

tografiê gazow¹ do podstawowych metod

badawczych stosowanych w toksykologii

[1,9,10,20].

W rutynowych badaniach toksykologicz-

nych zastosowanie znajduj¹ równie¿ inne

programy systematycznej analizy ksenobio-

tyków, wród których wymieniæ mo¿na sys-

tem Remedi-HS (Bio-Rad Laboratories,

Hercules CA US). Program Remedi-HS

oparty jest na zasadach chromatografii cie-

czowej (HPLC) i detekcji UV. System Re-

medi-HS umo¿liwia szybk¹ analizê ok. 500

leków i ich metabolitów w uk³adzie wielo-

punktowego pomiaru UV (multiwavelenght

ultraviolet detection). Niezale¿nie od uk³a-

dów sprzê¿onych w analizie metod¹ HPLC

wykorzystuje siê zró¿nicowan¹ zdolnoæ

detekcji, m.in. (UV, fluorescencyjnej, elek-

trochemicznej), której u¿ycie jest determi-

nowane strukturalnymi uwarunkowaniami

badanych zwi¹zków [23]. Najnowszym roz-

wi¹zaniem analitycznym jest zastosowanie

chromatografii cieczowej z spektrometri¹

masow¹ LC/MS. Osi¹gi detekcji dla ozna-

czeñ wielu zwi¹zków w tym uk³adzie s¹ ni¿-

sze ani¿eli uzyskane w systemie GC/MS i

najczêciej wystêpuj¹ w zakresie od 10 ng/

ml. Wzglêdy ekonomiczne sprawiaj¹, ¿e

technika ta nie znajduje jeszcze powszech-

nego zastosowania i tylko nieliczne placówki

w Polsce dysponuj¹ tymi mo¿liwociami

analitycznymi.

Notowane wysokie poziomy ksenobio-

tyków w p³ynach ustrojowych dla przypad-

ków zatruæ przekraczaj¹cych zakres stê¿eñ

terapeutycznych stwarzaj¹ mo¿liwoci wy-

korzystania dodatkowych metod potwierdza-

j¹cych. Najwy¿sz¹ wartoæ u¿ytkow¹ nale-

¿y przypisaæ m.in. testom wielokrotnej ko-

rekty wartoci RF opracowanych dla metod

chromatografii cienkowarstwowej, umo¿li-

wiaj¹cych analizê wiêkszej liczby leków

[9,10,23]. Podobne zastosowanie znajduje

system TOXI-LAB

218

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

R. Wachowiak

(Analytical systems,

Division of Marion Laboratories, Inc.) umo¿-

liwiaj¹cy szybki skrining (TLC) powszech-

nie nadu¿ywanych leków psychoaktywnych

i ich metabolitów w kompleksowym zesta-

wie analitycznym, zapewniaj¹cym proces

ekstrakcji, rozdzia³u i wizualizacji badanych

ksenobiotyków na chromatogramie [27].

Wspó³czesna analityka toksykologiczna

dysponuj¹ca nowoczesnymi technikami,

musi dokonaæ szybkiej i pewnej identyfika-

cji i analizy ilociowej substancji toksycznej

w materiale biologicznym i stanowi integral-

n¹ czêæ postêpowania diagnostycznego,

przydatnego w kontroli procesu skutecznej

detoksykacji. Przedstawione powy¿ej wybra-

ne zagadnienia, dotycz¹ce wykorzystania

niektórych rutynowych analitycznych metod

badawczych, stanowi¹ fragment wa¿nego

problemu zwi¹zanego z diagnostyk¹ che-

miczn¹ zatruæ, która ulega systematyczne-

mu doskonaleniu uwarunkowanego dyna-

micznym postêpem technicznym, którego

inicjacj¹ s¹ m.in. zapotrzebowania toksyko-

logii klinicznej i s¹dowej.

interest on SE-30 or OV-1 stationary phase. J.

Chromatogr. 1981, 220, 195.

2. Armbruster D.A., Krolak J.M.: Screening for drug

of abuse with the Roche ONTRAKT Assays. J. Anal.

Toxicol. 1992, 16, 172.

3. Baker I., Skelton R.: Estimation of HPLC retention

indices of narcotic analgesics and related drugs. J.

Chromatogr. 1980, 18, 153.

4. Baselt R.C., Cravey R.H.: A compendium of thera-

peutic and toxic concentrations of toxicologically sig-

nificant drugs in human biofluids. J. Anal. Toxicol.

1977, 1, 81.

5. Bogusz M., Erkens M.: Reversed phase high-per-

formance liquid chromatographic data base of reten-

tion indices and UV spectra of toxicologically relevant

substances and its interlaboratory use. J. Chroma-

togr. 1994, 674, 97.

6. Bogusz M. Wu M.: Standardized HPLC-DAD sys-

tems based on retention for systematic toxicological

screening. J. Anal. Toxicol. 1991, 15, 188.

7. Breiter J., Helger R., Lang H.: Evaluation of col-

umn extraction: A new procedure for the analysis of

drugs in body fluids. Forens. Sci. 1976, 7, 131.

8. Chamberlain J.: The analysis of drugs in biological

fluids. CRP Press. Boca Ration New York, London,

Tokyo 1995.

9. Clarks isolation and identification of drugs. Pharma-

ceutical Society, London 1986.

10. Daldrup T., Susanto F., Michalke P.: Combination

of TLC, GL and HPLC (RP 18) for rapid detection of

drugs and related compounds. Z. Anal. Chem. 1981,

308, 413.

11. Ferara S.D., Tedeschi L., Frison G., Castanga F.:

Solid phase extraction and HPLC-UV confirmation

of drug of abuse in urine. J. Anal. Toxicol. 1992, 16,

217.

12. Hill D.W., Kind A.J.: Reversed-phase solvent-gra-

dient HPLC retention indexes of drugs. J. Anal.

Toxicol. 1994, 18, 233.

13. Karch S.B.: Drug abuse handbook. CRS Press.

Boca-Raton, Boston, New York, Washington D.C.

1998.

14. Kintz P.: Drug testing in hair. CRS. Boca-Raton, New

York, London, Tokyo, 1996.

5. Kovats E.: Gaschromatographische charakteri-

sierung organischer Verbindungen. Teil 1: retentions

indices aliphatischer halogenide, alcohole, aldehyde,

und ketone. Helv. Chim. Acta 1958, 41, 1915.

16. Koves E.M., Wells B.S., Wells J.: Evaluation of a

photodiod array HPLC-based system for the detec-

tion and quantification of basic drugs in postmortem

blood. J. Forens. Sci. 1992, 37, 42.

17. Lambert W.E., Meyer E., De Leenheer A.P.: Sys-

tematic toxicological analysis of basic drugs by gra-

dient eluation of an alumina-based HPLC packing

material under alkaline condition. J. Anal. Toxicol.

1995, 19, 73.

18. Logan G.K., Stafford D.T., Tebbett J.R., Moore

C.M.: Rapid screening for 100 basic drugs and

metabolites in urine using cation exchange solid

phase extraction and high-performance liquid chro-

matography with diode array detection. J. Anal.

Toxicol. 1990, 14, 154.

19. Moffat A.C.: The standardisation of thin-layer chro-

matographic systems for the identification of basic

drugs. J. Chromatogr. 1975, 110, 341.

20. Moffat A.C.: Use of Se-30 stationary phase for the

gas-liquid chromatography of drugs. J. Chromatogr.

1975, 113, 69.

21. Mushoff F., Daldrup T.: Detection and quantifica-

tion of low concentrations of 11-nor-delta-9-tetrahy-

drocannabinol-9-carboxylic acid from minimal

amount of urine. J. Leg. Med. 1991, 104, 263.

22. Scheurer J., Moore C.M.: Solid-phase extraction of

drugs from biological tissues a review. J. Anal.

Toxicol. 1992, 12, 264.

23. Schütz H.: Modern screening strategies in analyti-

cal toxicology with special regard to new

benzodiazepines. Z. Rechtsmedizin. 1988, 24, 19.

24. Smith R., Turdley T., Gill R., Moffat A.: The appli-

cation of retention indices using the alkylarylketone

scale to the separation of the barbiturates by HPLC.

II. The effect of the stationary phase. Chromatogr.

1984, 19, 407.

25. Smith R.N.: Radioimmunoassay of drugs in body flu-

ids in a forensic context. Forensic Science Progress

3, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg. 1988.

26. Stead A.H., Moffat A.C.: A collection of therapeutic,

toxic and fatal blood drug concentration in man. Hu-

man Toxicol. 1983, 3, 437.

27. TOXI-LAB screening and confirmation of drug abuse.

Analytical Systems Division of Marion Laboratories

Irvine, CA. 1987.

28. Thelander G., Jonsson J., Schuberth J.: Is urine

a suitable material for the preliminary screening of

drugs in autopsy cases. Forens. Sci. Inter. 1983, 22,

189.

29. Weaver D.F., Camfield P., Frase A.: Massive carba-

mazepine overdose. Clinical and pharmacologic

observations in five episodes. Neurology 1988, 38,

755.

30. Yinon J.: Forensic application of mass spectrometry.

CRS Press Inc. 1995, 16.

Wnioski

1. Systematyczny wzrost uzale¿nieñ

oraz zatruæ rodkami psychoaktywnymi

wymaga odpowiednich metod diagnostycz-

nych, niezbêdnych w monitorowanej terapii

i skutecznej detoksykacji.

2. Homogeniczne, immunochemiczne

techniki diagnostyczne proponowane w ró¿-

nych modyfikacjach charakteryzuj¹ siê

znaczn¹ czu³oci¹, lecz ograniczon¹ spe-

cyficznoci¹, z racji reaktywnoci krzy¿owej

cross reactivity i wymagaj¹ odpowiednie-

go potwierdzenia innymi metodami badaw-

czymi.

3. Wród rutynowych metod potwier-

dzaj¹cych nale¿y wskazaæ na chromatogra-

fiê cieczow¹ (HPLC), gazow¹ (GLC) oraz

sprzê¿one uk³ady GC/MS i LC/MS, jako

najbardziej specyficzne systemy analitycz-

ne.

4. Komputerowe programy systema-

tycznej analizy toksykologicznej zapropono-

wane dla uk³adów HPLC-DIODA ARRAY

oraz GC/MS stanowi¹ istotny postêp w szyb-

kiej i skutecznej analizie zwi¹zków psycho-

aktywnych.

Pimiennictwo

1. Ardrey R., Moffat A.: Gas liquid chromatography

retention indices of 1318 substances of toxicological

Przegl¹d Lekarski 2001 / 58 / 4

219

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: