Data wykonania: 07.12.2006
Wydział: CHEMICZNY
Kierunek: BIOTECHNOLOGIA
Specjalizacja: BIOTECHNOLOGIA PRZEMYSŁOWA
Ćwiczenie nr 4
WYZNACZANIE AKTYWNOŚCI FOSFATAZ
Wykonała: DOROTA RESPONDEK
I Cel ćwiczenia:
Celem ćwiczenia było oznaczenie aktywności fosfataz w osadzie czynnym.
II Metody i materiały:
Odczynniki i sprzęt:
o - pipety automatyczne
o - wirówka
o - probówki plastikowe
o - roztwór Na2CO3
o - roztwór p-NPP-Na2
o - roztwór 0.14m NaCl
o - spektrofotometr SPEKOL 11 A
o - osad czynny
Metody:
Oznaczenie aktywności na podstawie pomiaru fotometrycznego ilości nitrofenolu,
powstałego w skutek enzymatycznej hydrolizy p-nitrofenylofosforanu.
III Przebieg ćwiczenia:
Do 12 probówek ( po 2 na każdą próbę) odmierzono po 1 ml osadu czynnego, a następnie dodano do każdej po 1 ml roztworu p-NPP-Na2. Odnotowano czas wykonania tej czynności i kolejno po 5, 10, 15, 20, 25 i 30 minutach przerywano inkubację kolejnych probówek (dodając po 1ml Na2CO3 w celu zatrzymania reakcji hydrolizy enzymatycznej).
Następnie probówki wirowano w ~ 3000- 3500 obr./min koło 2 minut.
Wykonano również 3 próby ślepe:
prob. nr 1 – 1ml NaCl + 1ml p-NPP-Na2 + 1ml Na2CO3
prob. nr 2 - 2ml NaCl + 1ml Na2CO3
prob. nr 3 – 1ml NaCl + 1ml osadu czynnego + 1ml Na2CO3
Pierwsza próba ślepa sporządzona została w celu wyzerowania spektrofotometru przy mierzeniu ekstynkcji prób właściwych, natomiast druga i trzecia pozwoliły wyznaczyć nam współczynnik korekcyjny.
Po wyznaczeniu współczynnika korekcyjnego i wyzerowaniu spektrofotometru, zmierzono ekstynkcje próbek.
Współczynnik korekcyjny = 0,055
Nr próbki
Ekstynkcja
Ekstynkcja pomniejszona o tło [x]
Czas inkubacji [min]
y = 24.224x - 0.1663 (stężenie)
Stężenie nitrofenolu uśrednione * [mg/dm3]
1.
0,348
0,293
5
6,931332
6,9313
0,381
0,326
7,730724
2.
0,360
0,305
10
7,222020
7,3310
0,369
0,314
7,440036
3.
0,408
0,353
15
8,384772
8,7845
0,441
0,386
9,184164
4.
0,662
0,607
20
14,537668
14,3681
0,648
0,593
14,198532
5.
0,742
0,687
25
16,475588
16,7905
0,768
0,713
17,105412
6.
0,714
0,659
30
15,797316
15,7973
0,512
0,457
10,904068
* W przypadku kiedy jedna z wartości w poszczególnej próbie była wartością odstającą w porównaniu do wcześniej uzyskanych, wartość tę odrzucono ( 0.369 w próbie 2 i 0.512 w próbie 6 )
Obliczenie aktywności fosfataz:
AF=Dp/Dt
Dp = y(30) - y(5) = 0,4474*30+3,8379 – 0,4474*5 -3,8379 = 11,185 [mg/dm3]
Dt=(30-5)/60= 0,42 [h]
AF=Dp/Dt=11,185/0,42 = 26,63 [mg/l*h]
IV Wnioski:
Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia można wywnioskować, że reakcja hydrolizy p-nitrofenylofosforanu przebiegła tak, jak przewidywano, tzn. stężenie nitrofenolu rosło wraz ze wzrostem czasu inkubacji. Świadczy to o aktywności fosfataz w badanych próbkach. W zakresie czasu 30 minut można zauważyć prostoliniowy przyrost nitrofenolu.
peroni69