System dwuybrydowy w drożdżach (IGIB UW).pdf

System dwuhybrydowy w drożdżach :

Drożdżowy system dwuhybrydowy (Y2H) to jedna z najpowszechniej stosowanych metod identyfikacji

oddziaływań między białkami. Metoda ta wykorzystuje fakt, że czynniki transkrypcyjne są zbudowane

modułowo tj, posiadają dwie niezależne funkcjonalne domeny: wiązania DNA (BD- binding domain ) i

domenę aktywatorową (AD- activator domain ). System używany do ćwiczeń wykorzystuje drożdżowy

czynnik transkrypcyjny GAL4. Białko "przynęty" jest w tym układzie wyrażane w fuzji z GAL4-DNA-BD

zaś "ofiara" - GAL4-AD (Fig1).

Fig1 : W systemie Y2H domeny funkcjonalne

czynnika transkrypcyjnego GAL4 (domena wiązania

DNA oraz aktywatorowa) są połączone z białkiem

"przynęty" ( BD -X) oraz potencjalnej "ofiary" ( AD -

Y). Stransformowana komórka wyraża, zatem dwa

białka hybrydowe, które w przypadku oddziaływania

są w stanie aktywować ekspresje genów

reporterowych.

Do ćwiczeń wykorzystamy szczep reporterowy AH109, który posiada genotyp:

MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4 Δ , gal80 Δ , LYS2::GAL1 UAS -GAL1 TATA -HIS3,

GAL2 UAS -GAL2 TATA -ADE2, URA3::MEL1 UAS -MEL1 TATA -lacZ ( James et al., 1996 , A. Holtz,

unpublished).

Szczep ten posiada 3 geny reporterowe: HIS3 (kodujący enzym szlaku biosyntezy histydyny), ADE2

(kodujący enzym szlaku biosyntezy adeniny) oraz MEL1 lub LacZ (kodujące odpowiednio α- i β-

galaktozydazę). Promotory tych genów są mają wprowadzone sekwencje UAS (ang: upstream activating

sequence (UAS GAL )) oraz TATA-box, obecne w promotorach genów GAL1, GAL10, GAL2 i GAL7 (Fig 3).

Warto zwrócić uwagę, że zastosowanie aż trzech genów reporterowych znacznie zmniejsza możliwość

uzyskania wyników fałszywie pozytywnych (jest to szczególnie ważne w metodach wysokoprzepustowych,

ang: high-throuput ), a usunięcie genów Gal4 i Gal80 dodatkowo zmniejsza ryzyko "wewnętrznej" aktywacji

genów repoterowych. Są one aktywowane tylko w sytuacji kiedy zachodzi oddziaływanie pomiędzy białkami

"przynęty " i "ofiary" , a zatem domeny czynnika transkrypcyjnego są w stanie odtworzyć funkcjonalny

natywny układ.

Fig2: Przykładowe wektory stosowane w Y2H.

Plazmid pGBKT7 - umożliwia sklonowanie białka

"przynęty" w fuzji z domeną wiążącą DNA (DNA-

BD) oraz znacznikiem c-Myc . Wektor pGADT7

umożliwia sklonowanie białka "ofiary" w fuzji z

domeną aktywatorową (AD) oraz znacznikiem HA .

Obydwa białka są wyrażane z konstytutywnych

promotorów genu ADH1 (dehydrogenaza

alkoholowa). Znaczniki umożliwiają wykrywanie

białek za pomocą odpowiednich przeciwciał

monoklonalnych.

Komórki szczepu reporterowego są auksotroficzne pod względem histydyny, tryptofanu, leucyny oraz

wykazują fenotyp charakterystyczny dla mutacji genów szlaku biosyntezy adeniny tj., akumuluja czerwony

pigment w przypadku jej niedoboru w pożywce. Fenotyp Trp - / Leu - - umożliwia selekcję transformantów tj.

komórek, które pobrały plazmidy kodujące "przynętę" i "ofiarę" (Fig 2). Oddziaływanie pomiędzy badanymi

białkami hybrydowymi spowoduje aktywację genów (GAL1 UAS -GAL1 TATA ) HIS3 oraz (GAL2 UAS -GAL2

TATA ) ADE2, czyli zniesienie fenotypu His - i Ade - (komórki stają się His + oraz stracą czerwone zabarwienie

nie akumuluja intermediatów szlaku biosyntezy adeniny). Dodatkowo w tym przypadku aktywowany jest

popularny gen reporterowy LacZ, kodujący β-galaktozydazę. Enzym ten rozkłada X-gal (5-bromo-4-chloro-3-

indolilo-β-D-galaktopiranozyd) do niebieskiego, nierozpuszczalnego produktu, który powoduje zabarwienie

kolonii drożdży na szalce lub membranie. Możliwe są również ilościowe analizy spektrofotometryczne

aktywności β-galaktozydazy w drożdżowych ekstraktach białkowych, pozwalające na oszacowanie siły

oddziaływania. Dobierając odpowiednie podłoża selekcyjne jesteśmy, zatem w stanie zidentyfikować klony,

w których zachodzi oddziaływanie pomiędzy "przynętą" a "ofiarą" .

Ref 4.

Fig3: Komórki drożdży posiadają liczne geny odpowiedzialne

za metabolizm galaktozy. Należą do nich tzw. geny strukturalne

( GAL1 , GAL10 , GAL2 i GAL7 ) kodujące enzymy szlaku

katabolizmu galaktozy oraz geny regulatorowe ( GAL4 , GAL80 i

GAL3 ). Przez wiele lat drożdżowy czynnik transkrypcyjny

GAL4 - regulujący ekspresje genów strukturalnych- służył jako

model badawczy aktywacji transkrypcji u Eukaryota . Schemat

obok ilustruje regulację transkrypcji przez czynnik Gal4. W

warunkach nieindukujących Gal80 blokuje domenę

aktywatorową Gal4, uniemożliwiając tym samym aktywację

transkrypcji.

W warunkach indukcji galaktozą Gal80 odłącza się od Gal4, co

umożliwia jego domenie aktywatorowej rekrutację kolejnych

białek zaangażowanych w transkrypcję. Gal80 jest

transportowany na teren cytoplazmy, gdzie wiąże się silnie z

Gal3. Grr1 i Dsg1 to enzymy związane z systemem

ubikwitynacji (regulują poziomy Gal4) (4).

Literatura:

1) Van Criekinge W, Beyaert R "Yeast Two-Hybrid: State of the Art" .

2) Guo D, Rajamäki ML, Valkonen J. (2008) " Protein-protein interactions: the yeast two-hybrid system"

Methods Mol Biol. 451:421-39.

3) Matchmaker™ GAL4 Two-Hybrid System 3 & Libraries User Manual - Clontech.

4) Traven A, Jelicic B, Sopta M. (2006) "Yeast Gal4: a transcriptional paradigm revisited" EMBO reports 7 ,

5, 496–499.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: