Antybiotyki – substancje chemiczne wytwarzane przez drobnoustroje i mające w dużych rozcieńczeniach zdolność zabijania lub hamowania wzrostu innych drobnoustrojów – pierwsza definicja (Waksman S.A. 1942)
„Antybiotyki są małocząsteczkowymi substancjami naturalnymi, najczęściej pochodzenia drobnoustrojowego lub ich półsyntetycznymi modyfikacjami albo syntetycznymi analogami, które w małym stężeniu działają wybiórczo na struktury i procesy biologiczne, hamując wzrost lub rozmnażanie komórek” – definicja współczesna
Miejsce i sposób oddziaływania antybiotyków
- Synteza kwasów nukleinowych – replikacja DNA lub synteza RNA
- Synteza białka na rybosomach
- Transport przez błony biologiczne
- Synteza składników ściany komórkowej
- Procesy energetyczne
Zakres działania antybiotyków
- Aktywność przeciwbakteryjna
- Aktywność przeciwgrzybowa
- Aktywność przeciwwirusowa
- Aktywność przeciwnowotworowa
- Aktywność immunosupresyjna
- Aktywność przeciwrobacza
- Aktywność przeciwpierwotniakowa
- Aktywność insektycydowa
- Aktywność herbicydowa
Podział antybiotyków ze względu na budowę chemiczną
- Pochodne aminokwasów (antybiotyki β-laktamowe, polipeptydowe, glikopeptydowe, lipo peptydowe
- Pochodne cukrów (amino glikozydy, glikolipidy)
- Antybiotyki makrocykliczne (makrolidy właściwe, makrolidy polienowe)
- Chinony i ich pochodne (antracykliny, tetracykliny, benzochinony)
- Inne antybiotyki: nukleozydy, polietery, związki aromatyczne, związki steroidowe, związki fosfoorganiczne
Proces biotechnologiczny wytwarzania antybiotyków
1. Przygotowanie wyjściowego materiału posiewowego w hodowli wgłębnej
à Podłoża zawierają łatwo przyswajalne organiczne źródła węgla i energii, np. glukozę, sacharozę, surowce skrobiowe; źródło azotu – np. jony amonowe i azotanowe, wyciągi mięsne; zestaw soli nieorganicznych
à Poza tym podłoża wzbogacone są w kompleksowe surowce, takie jak namok kukurydziany, wyciągi lub hydrolizaty mięsne, wyciągi drożdżowe
à Podłoże uzupełniane jest dodatkiem CaCO3, w celu neutralizacji powstających kwasów organicznych
I etap w kolbach wstrząsanych
II etap w bioreaktorach
2. Proces biosyntezy antybiotyków
Prowadzenie hodowli drobnoustrojów w bioreaktorze z mieszaniem i napowietrzaniem w podłożu zapewniającym pełne wykorzystanie metabolicznego potencjału szczepu produkcyjnego
à Podstawowym składnikiem podłoża jest źródło węgla i energii, wykorzystywane do namnażania komórek i syntezy energii, wykorzystywane do namnażania komórek i syntezy produktu: monosacharydy i disacharydy (sacharoza, laktoza)
à Źródło azotu: sole amonowe, woda amoniakalna, najczęściej mąka sojowa lub kukurydziana oraz namok kukurydziany
à Zestaw soli mineralnych
à CaCO3 jako czynnik neutralizujący powstające kwasy organiczne
à Podłoża produkcyjne mogą zawierać specjalne składniki, takie jak czynniki wzrostowe (wybrane aminokwasy i witaminy) i prekursory produktu końcowego
à Wyodrębnienie antybiotyków z zawiesiny pohodowlanej oraz ich oczyszczanie i rozdzielanie
Derepresja – w fazie wzrostu logarytmicznego następuje represja enzymów odpowiedzialnych za biosyntezę antybiotyków (nie są potrzebne) (represja kataboliczna). W fazie stacjonarnej komórki nie rosną już tak intensywnie, w takich warunkach następuje derepresja syntezy enzymów (odblokowanie represji syntezy enzymów z fazy wzrostu logarytmicznego)
Mechanizmy represji (derepresji) katabolicznej w biosyntezie antybiotyków
- Efekt glukozowy – (nie tyle glukoza, ale stężenie głównego węglowodanu wytwarzanego przez komórkę jest istotne). Gdy stężenie węglowodanu jest zbyt wysokie, dochodzi do wzrostu biomasy, a nie syntezy antybiotyków. Wszystkie mikroorganizmy, jeżeli w środowisku jest glukoza, będzie ona pierwsza wykorzystana do wzrostu (stąd glukoza w nazwie efektu). Gdy stężenie jest wysokie, następuje namnażanie się komórek; gdy stężenie jest niskie, przechodzą w idiofazę, fazę stacjonarną, dochodzi do syntezy antybiotyków.
Laktoza jest wykorzystywana w fazie stacjonarnej (komórka nie ma szans wejść w fazę wzrostu logarytmicznego.
Efekt glukozowy to odpowiednie stężenie węglowodanu obecnego w danym momencie w środowisku. Musi ono być niskie, aby komórki nie przechodziły w produkcję biomasy, ale pozostawały w fazie stacjonarnej (idiofazie)
- Represja biosyntezy związana z nadmiarem jonu amonowego w podłożu (główne źródło azotu, oprócz mocznika, aminokwasów, ale także kwasów nukleinowych czy białka) – będzie jako pierwszy wykorzystywany jako źródło azotu. Przy dużym stężeniu wzrost logarytmiczny (jak w efekcie glukozowym). Aby doszło do de represji katabolicznej, musi dojść do niedoboru jonu amonowego
- Represja biosyntezy związana z nadmiarem jonu fosforanowego w podłożu (stężenie nie powinno przekraczać 10 mmol/dm3, a czasami powinno wynosić nawet poniżej 1 mmol/dm3) – jon fosforanowy jest wykorzystywany do produkcji ATP, gdy jest dużo ATP, następuje produkcja biomasy;
Mechanizmy sprzyjające syntezie antybiotyków (autoregulatory) - Czynnik A (lakton kwasu 2-izokapronoilo-3-hydroksymetylo-4-hydroksybutanowego) wytwarzany przez szczepy Streptomyces griseus produkujące streptomycynę
Przechowywanie kultury macierzystej w bankach kultur:
- Przechowywanie mikroorganizmów w pożywce lub na podłożu stałym w niskiej temperaturze (2-6oC). Metoda ta wymaga jednak częstego przeszczepiania (raz na 8-16 tygodni) oraz charakteryzuje się dużym zagrożeniem (zakażenia, mutacje)
- Suszenie à w temperaturze pokojowej pod normalnym ciśnieniem; à pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności czynnika pochłaniającego wodę (np. P2O5); à na drodze sublimacji ze stanu głębokiego zamrożenia. Na przykład suszenie hodowli bezpośrednio na podłożu wzrostowym (grzyby strzępkowe i promieniowce)
- Zamrożenie (1oC/min lub lepiej szybciej) oraz przechowywanie kultury macierzystej w stanie zamrożonym (od -18oC do -80oC) lub w ciekłym azocie (w temperaturze -196oC). Stosuje się tu substancje ochronne, takie jak: serwatka, bulion, mleko, pepton, żelatyna, surowica krwi, węglowodany w postaci roztworów glukozy, sacharozy, laktozy i dekstranu, roztwory aminokwasów, jak kwas asparaginowy, glicerol. Ten sposób umożliwia przechowywanie kultur przez kilka lat. (pobiera się z początku fazy stacjonarnej)
1. Liofilizację (oziębienie i zamrożenie zawiesiny komórek w temperaturze -70oC, a następnie wysuszenie jej w wysokiej próżni) bezpośrednio w podłożu hodowlanym lub po uprzednim zawieszeniu w odpowiednich roztworach zawierających czynniki ochronne – krioprotektanty (sacharozę, odtłuszczone mleko w proszku, glicerol, surowicę końską). Proces liofilizacji umożliwia przechowywanie kultur w hermetycznych ampułkach przez wiele lat
2. Rozmrożenie (1oC/min, najlepiej w łaźni wodnej o temperaturze 40oC) lub uwodnienie kultury (zaszczepu) macierzystej
3. Przygotowanie zaszczepu roboczego (ożywianie zaszczepu macierzystego)
I etap: hodowla na skosach lub płytkach Petriego, tzn namnażanie na podłożu stałym
II etap: przeniesienie kultury z podłoża stałego na pożywkę płynną przez dokonanie zmywania lub przeniesienie „kłaczka”
III etap: przeniesienie kultur namnożonych na pożywkach płynnych (zaszczepu macierzystego) do większej objętości pożywki à zaszczep roboczy (butelki „Roux”, kolby stożkowe)
4. Przetrzymywanie zaszczepu roboczego w optymalnych warunkach stacjonarnych, okresowo mieszając lub ciągle wytrząsając przy użyciu wytrząsarek (w zależności od wymogów kultury drobnoustrojów) à zaszczep roboczy pierwszy
5. Zaszczep roboczy drugi i dalsze w wyniku kolejnych pasaży
6. Czasami przed kolejnym pasażem lub zaszczepieniem do produkcji stosuje się regenerację (aktywację kultury, np.
- W przypadku drożdży hodowlanych: silne zakwaszenie środowiska
- W przypadku grzybów pleśniowych: przeztrzymywanie grzybni w formie wegetatywnej przez pewien czas w warunkach, które nie sprzyjają rozwojowi, np. w niskiej temperaturze
- W przypadku przygotowywania zakwasów mleczarskich (na przykładzie mikroflory zakwasu do ukwaszania śmietanki): 2-3 krotne rozcieńczenie zaszczepu świeżo spasteryzowanym, schłodzonym mlekiem odtłuszczonym i przetrzymywanie przez 1 godzinę w temperaturze 26-30oC
7. Zaszczepienie do produkcji
Elesmera