Trzmiel Tadeusz, Emilia Papis

Instytut Biochemii Technicznej

Biodegradacja związków alicyklicznych

1. Podstawowe dane o związkach alicyklicznych

Węglowodory cykloalifatyczne, węglowodory alicykliczne, cykliczne węglowodory alifatyczne, nazwy stosowane wymiennie,  zawierające niearomatyczny układ pierścieniowy lub kilka takich układów albo układy pierścieniowe skondensowane. Grupa obejmuje: cykloalkany, cykloalkeny, cykloalkadieny. Węglowodory te występują w znacznych ilości w ropie naftowej szczególnie ropa naftowa w Kalifornii zawiera większe ilości cykloakanów [3,4]. Udział wybranych składników w ropie naftowej przedstawia tabela 1.

Tabela 1. Udział wybranych składników w ropie naftowej [wg 22]

                     * wartości maksymalne

Cykloalkany to węglowodory pierścieniowe o ogólnym wzorze CH.Atomy węgla połączone są w nich w taki sposób, że tworzą pierścień. Możliwe jest istnienie pierścieni o dowolnej wielkości. Jednakże najczęściej spotykany w chemii organicznej cykloalkan ma pierścień sześcioczłonowy (cykloheksan). Większość cykloalkanów charakteryzuje się niewielką reaktywnością chemiczną. Wyjątkiem są pierścienie małe – o trzech lub czterech członach – które są aktywne chemicznie i zachowują się podobnie jak alkany. Przyczyną mniejszej trwałości tych związków są występujące w ich cząsteczkach silnie naprężenia wywołane tym, że wiązania, w których biorą udział atomy węgla, nie mogą w nich przyjąć uprzywilejowanej orientacji tetraedrycznej. Cyklalkany ulegają głównie reakcjom wolnorodnikowego podstawiania.

Cykloalkany mogą przyjmować rozmaite konformacje, czyli kształty. Najtrwalszą konformacją cykoloheksanu jest konformacja krzesłowa. W konformacji tej jeden z dwóch atomów wodoru, z którymi połączony jest każdy atom węgla, zajmuje położenie aksjalne, a drugi – ekwatorialne. Struktura krzesłowa może ulec inwersji do innej konformacji krzesłowej, w której wszystkie wiązania aksjalne zamieniają się w ekwatorialne, a wszystkie ekwatorialne – w aksjelne. Przejście jednej konformacji krzesłowej w drugą następuje przez wysokoenergetyczne stadium konformacji łodzi. Jeśli przy którymś z atomów węgla w pierścieniu występuje podstawnik, najtrwalsza jest ta konformacja krzesłowa, w której zajmuje on położenie ekwatorialne. W położniku aksjalnym podstawnik poddany jest oddziaływaniom synklinalnym z wiązaniami C-C w pierścieniu [1].

U pochodnej cykloheksanu, który w cząsteczce zawiera dwa jednakowe podstawniki możliwe istnienie izomerów geometrycznych ( cis i trans) [3]. Izomery cis-trans różnią się jeden od drugiego tylko w sposobie w jaki atomy lub grupy atomów są położone w przestrzeni. Niemniej ta różnica jest dostateczna by różniły się one właściwościami fizycznym i chemicznymi. Izomery cis i trans są różnym związkami. W przeciwieństwie do konformerów nie mogą one przechodzić wzajemnie przez rotację wokół wiązania węgiel-węgiel. W tym przykładzie cykliczna struktura uniemożliwia rotację wokół wiązań pierścienia. Izomery cis i trans mogą być oddzielne jeden od drugiego i przechowywane w temperaturze pokojowej zazwyczaj bez przechodzenia wzajemnie w siebie. Izomeria cis-trans może być ważna w określaniu biologicznych właściwości cząsteczek. Na przykład cząsteczka, w której dwie grupy reaktywne znajdują się w pozycji cis będzie oddziaływała inaczej z enzymem lub miejscem wiązania receptora biologicznego niż izomer z tym samymi dwiema grupami położonymi w pozycji trans [50].

Cykloalkany możemy podzielić na następujące grupy:

1.Cykloalkany monopierścieniowe np. cyklopropan, cyklobutan, cyklopentan

2.Cykloalknay dwupierścieniowe

- dwa pierścienie mogą być połączone przez jeden atom węgla i wtedy nazywamy je spiranami. Są to rzadko spotykane związki (np. spiropentan, spiro[3,4]oktan)

- dwa pierścienie połączone przez dwa wspólne atomy węgla (np. bicyklo[3.3.0]oktan, bicyklo[2.2.2]oktan lub bicyklo[3.2.1]oktan, bicyklo[2.2.1]heptan lub nortricyklen)

3.Węglowodory wielopierścieniowe

- steroidy – związki naturalne występujące we wszystkich organizmach roślinnych i zwierzęcych, są pochodnymi czteropierścieniowego węglowodoru, zbudowanego z trzech pierścienie sześcioczłonowych jednego pięcioczłonowego. We wszystkich naturalnych steroidach złącza pierścieni B i C oraz C i D mają konfiguracje trans. Pierścienie A i B mogą mieć złącze trans lub cis, ale układ cis jest rzadko spotykany. W licznych steroidach przy atomach 10 i 13 znajdują się grupy metylowe. Inne podstawniki często zajmują położenie 3, 11, 17.

- węglowodory klatkowe – znane są liczne policykloalkany, których szkielety węglowe tworzą struktury przestrzenne, przypominające klatki np. tetrahedran, pryzman, kuban, adamantan, dodekahedran. Węglowodory klatkowe nie znajdują zastosownia praktycznego [2].

Cykloalkeny są węglowodorami pierścieniowymi posiadającymi podwójne wiązanie w obrębie pierścienia. Reakcje cykloalkenów są analogiczne do reakcji alkenów z wyjątkiem reakcji polimeryzacji. Rozpatrując budowę produktów tych reakcji należy pamiętać, że w reakcji addycji struktura pierścieniowa nie ulega zmianie, natomiast w reakcji utleniania, połączonych z całkowitym rozerwaniem wiązania podwójnego, struktura pierścienia ulega rozpadowi, a odpowiednie grupy funkcyjne znajdują się na końcach łańcucha węglowego cząsteczki produktu reakcji. Ulegają reakcjom addycji zarówno elektrofilowej jak i wolno rodnikowej [5].

Poniżej przedstawiono przykładowe wzory chemiczne związków alicyklicznych:

4. BIODEGRADACJA

4.1. Inicjacja procesu biodegradacji

Cyklopropan

Cyklopropan jest najprostszym połączeniem alicyklowym zawiera w pierścieniu trzy atomy węgla. Cyklopropan jest połączeniem dość trwałym. Napięcie istniejące w trójczłonowym pierścieniu powoduje jednak pewna tendencję do rozerwania pierścienia i utworzenia pochodnych zwykłego propanu. Reakcje tego związku są podobne do rekcji związków alifatycznych. Cyklopropan ma pewne znaczenie praktyczne, jako środek do narkozy chirurgicznej [3].

Cyklopropan i metylocyklopropan jest utleniany przez Methylococcus capsulatus odpowiednio do cyklopropanolu i hydroksymetylocyklopropanu (rys. 1.)[16].

Rys. 1. Inicjacja procesu biodegradacji cyklopropanu przez Methylococcus capsulatus        [wg 16]

Cyklopentan

Cyklopentan jest zbudowany z pięciu grup metylenowych połączonych w pierścień. Cyklopentan jest cieczą o temperaturze wrzenia 50C. Można go otrzymać syntetycznie z kwasu adypinowego [3].

Cyklopentan jest utleniany do cyklopentanolu i cyklopentanonu przez Pseudomonas sp. Ta sama bakteria zamienia metylocyklopentan do 3-metylocyklopentanonu (rys. 2.) [16].

Rys. 2. Inicjacja procesu biodegradacji cyklopentanu i metylocyklopentanu przez Pseudomonas sp [wg 16]

Cykloheksan, metylocykloheksan

Cykloheksan jest cieczą o temperaturze wrzenia 80-81C. Ma pewne znaczenia jako rozpuszczalnik. Pod względem chemicznym zachowuje się jak połączenia alifatyczne. Wykazuje pewną skłonność do aromatyzacji np. podczas ogrzewania z dymiącym kwasem siarkowym przechodzi w sulfonową pochodną benzenu.

Pierścień cykloheksanu nie posiada płaskiej budowy nie wykazuje jednak żadnych skłonności do pękania pierścienia. Cykloheksan można otrzymać przez uwodornienie benzenu, poza tym cykloheksan można otrzymać syntetycznie z kwasu pimelinowego. Przez uwodornienie toluenu można otrzymać metylocykloheksan [3].

Cykloheksan występuje naturalnie w ropie naftowej, występuje również jako strukturalna część składowa wiele interesujących i ważnych cząsteczek np. cykliczne terpeny, sterole i karotenoidy [14].

Mało wiemy o mikrobiologicznej degradacji alicyklicznych węglowodorów cykloheksanu i metylocykloheksanu. Okazały się one oporne na mikrobiologiczny atak i izolowanie czystych kultur zdolnych wykorzystywać te substancje jest niezmiernie trudne [10]. Zdolności do wykorzystywania cykloheksanu jako źródła węgla wykazuje Pseudomonas sp., który był odpowiedzialny za początkowe utlenianie pierścienia cykloheksanu [14] do cykloheksanonu, epoksycykloheksanu i cykloheksanodiol [16] (rys.3). Ten drobnoustrój może rosnąć na szerokim zakresie węglowodorów włączając w to węglowodory aromatyczne, węglowodory o prostym łańcuchu i pochodne cykloheksanu [14].

Droga biodegradacji dla cykloheksanu wymagającej początkowego hydroksylowania do cykloheksanolu następnie degradacja cyklohekanolu drogą poznaną u Nocardia globerula i Acinetobacter tj. utlenianie z cykloheksanolu przez dehydrogenazę do cykloheksanonu następnie monooksygenaza wstawiającą tlen do pierścienia i powstaje -kapronolakton i dalej rozpad laktonu przez 6-hydroksykapronian i do kwasu adypinowego [10].

Rys. 3. Inicjacja procesu biodegradacji cykloheksanu przez Pseudomonas sp. [wg 16]

Nocardia petrolephila posiada niezwykłe zdolności do wzrostu na węglowodorach alicyklicznych jako źródle węgla i energii oraz wysoką wydajność sprawnego wykorzystania tych węglowodoru. Początkowym krokiem degradacji metylocykloheksanu może być utlenienie do utworzenia 3-metylocykloheksanolu następnie odwodornienie do utworzenia ketonu, 3-metylocykloheksanonu [15]. Szczep Pseudomonas sp. zamienia metylocykloheksan do 4-metylocykloheksanonu, natomiast szczep Pseudomonas aeruginosa przekształca ten alicykliczny związek do hydroksymetylocykloheksanu (rys. 4) [16].

Rys. 4. Inicjacja procesu biodegradacji metylocykloheksanu [wg 16]

Cykoheksen, 1-metylocykloheksen, 4-metylocykloheksen

Cykloheksen może być również hydroksylowany. Cykloheksen jest hyroksylowany przez Aspergillus niger NCIM 612 do cykloheksen-3-olu i trans-cykloheksen-3,4-diolu. Tak samo grzyby hydroksylują 1-metylocykloheksen i 4-metylocykloheksen do alkoholi i ketonów (rys.5) [16].

Rys. 5. Inicjacja procesu biodegradacji cykloheksenu, 1-metylocykloheksenu, 4-metylocykloheksenu przez Aspergillus niger [wg 16]

Kwas cykloheksanokarboksylowy i kwas 3-cykloheksenokarboksylowy

Kwas cykloheksanokarboksylowy i jest przekształcany przez Alcaligenes sp. lub Arthrobacter sp. do kwasu 4-hydroksycykloheksanokarboksylowego, natomiast kwas 3-cyklo heksenokarboksylowy jest hydroksylowany  przez Pseudomonas putida do kwasu 2-hydroksycykloheks-3-enokarboksylowego (rys. 6) [16].

Rys. 6. Inicjacja procesu biodegradacji kwasu cykloheksanokarbksylowego i kwasu 3-cykloheksenokarboksylwego [ wg 16]

4.2. Biodegradacja związków pierścieniowych pięcioczłonowych

Cyklopentanol

Pseudomonas sp. szczep NCIMB 9872, który jest zdolny do wzrostu na cyklopentanolu jako jedynym źródle węgla, został odizolowany ze słodkowodnego strumienia w Illinois przez P. J. Chapman blisko trzydzieści lat temu. Ustalona biochemiczna drogę dla biodegradacji cyklopentanolu przez Pseudomonas sp. szczep NCIMB 9872 pokazana jest na rys.7 [17].

Pierwszym krokiem w czasie procesu biodegradacji cyplopentanolu przez Pseudomonas sp. szczep NCIMB 9872 jest jego zamiana do cyklopentanonu przy udziale dehydrogenazy cyclopentanolowej (EC 1.1.1.163). Następnie reakcja Baeyer-Villiger, aby powstał 5-walerolakton przy udziale enzymu 1,2-monooksygenazy cyklopentanonowej (EC 1.14.13.16), reakcja ta wymaga obecności NADPH(NADPH+H). Dalej 5-walerolakton jest przekształcany kolejno przez kwas 5-hydroksywalerianowy, kwas 5-oksowalerianowy i dalej do kwasu glutarowego przy udziale odpowiednio enzymów hydrolazy 5-walerolaktonowej, dehydrogenazy 5-hydroksywalerianowej, dehydrogenazy 5-oksowalerianowej [18].

Kwas glutarowy przechodzi drogę -oksydacji dla szczepu Pseudomonas fluorescens, który uzyskuje dwutlenek węgla i 2 mole acetylo-CoA przez kolejności reakcji [18]:

kwas glutarowyàglutarylo-CoAàglutakonylo-CoAàkrotonylo-CoAà

-hydroksybutyrylo-CoAà acetoacetylo-CoAà2 acetylo-CoA [17, 18, 16].

Enzymy:

1. dehydrogenaza cyklopentanolowa EC 1.1.1.163

2. 1,2-monooksygenaza cyklopentanonowa EC 1.14.13.16

3. hydrolaza 5-walerolaktonowa

4. dehydrogenaza 5-hydroksywalerianowa

5. dehydrogenaza 5-oksowalerianowa

Rys. 7. Droga biodegradacji cyklopentanolu przez Comamonas sp szczep NCIB 9872 [wg 17]

4.3. Biodegradacja związków pierścieniowych sześcioczłonowych

Cykloheksanol

Cykloheksanol jest łatwopalnym płynem. Posiada on właściwości typowego drugorzędowego alkoholu alifatycznego. Cyklohekanol stosowany jest jako rozpuszczalnik, a ponadto służy do otrzymywania cykloheksanonu. Cykloheksanon stanowi obecnie ważny surowiec dla przemysłu włókien syntetycznych, takich jak nylon, zwanych ogólnie superpoliamidami. Nocardia globerula CL1, Acinetobacter NCIB 9871, Peudomonas i Xanthobacter mają zdolność, by wykorzystywać cykloheksanolu jako jego jedyne źródło węgla i energii. Mogą degradować cykloheksanol do kwasu adypinowego i wykorzystywać energię wygenerowaną w tym procesie. To wskazuje, że degradacja kwasu adypinowego jest kontynuowana do dwutleneku węgla przez proces oksydacji [3, 11, 13].

Degradacja przez Acinetobacter NCIB 9871 przebiega przez szereg następujących reakcji [10] (rys.8) utlenianie z cykloheksanolu przez dehydrogenazę cykloheksanolowa (EC 1.1.1.245) do cykloheksanonu, który jest substratem dla 1,2-monooksygenazy cykloheksanonowej (EC 1.14.13.22). Enzym katalizujący utleniania Baeyera-Villiger prowadzi do wprowadzenia atomu tlenu do pierścienia. Uzyskany kapronolakton jest rozrywany przez laktonazę kapronolaktonową (EC 3.1.1.?) i powstaje kwas 6-hydroksykapronowy. Kolejnym etapem degradacji cykloheksanolu przez Acinetobacter NCIB 9871 jest utworzenie semialdehydu adypinowego dzięki dehydrogenazie 6-hydroksykapronianowej (EC 1.1.1.285). Następnie związek ten jest przekształcany do kwasu adypinowego przez dehydrogenazę semialdehydu adypinowego (EC 1.2.1.63). Degradacja kwasu adypinowego jest kontynuowana do dwutleneku węgla przez proces oksydacje [11,12].

Enzymy:

1. dehydrogenaza cykloheksanolowa EC 1.1.1.245

2. 1,2-monooksygenaza cykloheksanonowa EC 1.14.13.22

3. laktonaza kapronolaktonowa EC 3.1.1.?

4. dehydrogenaza 6-hydroksykapronianowa EC 1.1.1.285

5. dehydrogenaza semialdehydu adypinowego EC 1.2.1.63

Rys. 8. Droga biodegradacja cykloheksanolu przez Acinetobacter NCIB 9871 [wg 13]

4.3.1. Biodegradacja związków sześcioczłonowych zwierających w cząsteczce połączoną z pierścieniem grupę karboksylową

Kwas cykloheksanokarboksylowy

Mikrobowy katabolizm z aromatycznymi i alifatycznymi węglowodorami oraz ich pokrewnymi kwasami został opisany przez kilku badaczy, ale mało jest dostępnych informacji o mikrobowym katabolizmie nasyconych cyklicznych związków. Norris i Trudgill opisywali metabolizm cykloheksanu przez Nocardia i pokazali 6-hydroksykapronian i kwas adypinowy jako związki pośrednie w tej drodze degradacji. Wyniki te wskazują, że mikrobowy katabolizm nasyconych związków cyklicznych może włączać hydrolityczny rozłam nasyconego pierścienia później kroki utleniające [19].

Kwas cykloheksanokarboksylowy są zdolne wykorzystywać liczne bakterie jako źródło energii i węgla [28]. Zdolność degradacji kwasu cykloheksanokarboksylowego posiadają następujące szczepy: Arthrobacter, Pseudomonas putida, Acinetobacter anitratum, Alcaligenes faecalis, Corynobacterium cyclohexanicum.

Szczep Arthrobacter katabolizuje kwas cykloheksanokarboksylowy przez drogę włączającą aromatyzację pierścienia zanim zostanie on rozerwany. Droga obejmuje następujące związki pośrednie: kwas trans-4-hydroksycykloheksanokarboksylowy, kwas 4-oksocykloheksanokarboksylowy, kwas p-hydroksybenzoesowy, kwas protokatechanowy oraz kwas 3-ketoadypinowy (rys. 9) [19,29].

...