Ćwiczenie nr 9
Repetytorium
1. Struktura, podział i właściwości białek.
2. Biomedyczne znaczenie białek.
3. Trawienie i wchłanianie białek
4. Koloidy
5. Własności zoli liofobowych i liofilowych
6. Dializa
Część praktyczna
1. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny
2. Własności ochronne koloidów liofilowych
3. Wytrącanie i wysalanie białek
4. Amfoteryczny charakter białek
5. Koagulacja roztworów koloidowych
1. Struktura, podział i właściwości białek
Struktura drugorzędowa - opisuje konformacje łańcuchów (helikalną i pofałdowaną) powstałe w wyniku utworzenia wiązań wodorowych między grupami karbonylowymi i amidowymi głównego łańcucha polipeptydowego oraz mostków disulfidowych.
Struktura trzeciorzędowa określa trójwymiarowe pofałdowanie danego łańcucha polipeptydowego wywołane wewnątrzcząsteczkowym oddziaływaniem łańcuchów bocznych. Strukturę tą stabilizują wiązania wodorowe, mostki disulfidowe i siły van der Waalsa.
Struktura czwartorzędowa - pojęcie to obejmuje występujące w wielu białkach asocjacje monomerów białkowych o oddzielnej strukturze drugo- i trzeciorzędowej w kompleksy oligomeryczne. Asocjacja i agregacja zachodzi w wyniku oddziaływań między polarnymi, zjonizowanymi i niepolarnymi łańcuchami bocznymi aminokwasów, są to oddziaływania: dyspersyjne, hydrofobowe, jonowe, wodorowe, w kilku wypadkach stabilizacja dzięki mostkom disulfidowym. Przykładami białek o strukturze czwartorzędowej są hemoglobina, wirus mozaiki tytoniowej, dehydrogenaza białczanowa, dehydrogenaza alkoholowa.
Podział białek
Ze względu na różnorodność budowy białek trudno dokonać ścisłej klasyfikacji białek. Najstarszy podział białek oparty został na różnicach w rozpuszczalności białek i kształcie cząsteczek.
Wyróżnia się białka:
1) fibrylarne - o strukturze włóknistej, nierozpuszczalne w wodzie
2) globularne – o strukturze kulistej, rozpuszczalne w wodzie i roztworach
soli nieorganicznych. Dzieli się je na białka proste (zbudowane tylko
z aminokwasów) i białka złożone (zawierają grupy niebiałkowe jak cukry,
tłuszcze, kwasy nukleinowe, reszty kwasu fosforowego, jony metali).
1. Mają charakter wielkocząsteczkowy ( białka nie dializują ale ich roztwory wykazują cechy koloidów).
2. Wywierają ciśnienie koloidoosmotyczne.
3. Wędrują w polu elektrycznym (elektroforeza).
4. Ulegają wysalaniu ( (NH4)2SO4, Na2SO4, NaCl).
5. Skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo.
6. Pochłaniają światło przy 280 nm ( Trp i Tyr ).
7. Wykazują duży współczynnik załamania światła (oznaczanie białka metodą refraktometryczną).
8. Są wrażliwe na podwyższoną temperaturę i inne czynniki denaturujące.
Właściwości chemiczne białek
kation białkowy białkowy jon obojnaczy anion białkowy
pH<pI pI pH>pI
-nadmiar ładunku - rozpuszczalność i hydratacja -nadmiar ładunku
dodatniego minimalne ujemnego
-wzrost rozpuszczalności - brak wędrówki w polu -wzrost rozpuszczalności
i hydratacji elektrycznym i hydratacji
Punkt izoelektryczny - wartość pH, w której liczba protonów związanych z grupami zasadowymi jest równa liczbie protonów odszczepionych przez grupy kwasowe. Zależy w pewnym stopniu od środowiska (obecności soli).
O całkowitym ładunku białka decydują wszystkie grupy funkcyjne występujące w tym białku, wpływ zaś końcowych grup aminowej i karboksylowej jest minimalny.
2. Biomedyczne znaczenie białek
Ze względu na funkcje biologiczne białka możemy podzielić :
1.Enzymy (dehydrogenazy, kinazy) - regulują szybkość procesów
fizjologicznych,
2. Białka zapasowe (ferrytyna, mioglobina),
3. Białka regulatorowe (hormony, białka wiążące się z DNA),
4. Białka strukturalne (kolagen, proteoglikany),
5. Białka ochronne (immunoglobuliny, czynniki krzepnięcia krwi),
6. Białka transportujące (hemoglobina, lipoproteiny osocza),
7. Białka uczestniczące w skurczu (aktyna, miozyna, tubulina).
Białka są niezbędne do prawidłowego wzrostu i rozwoju organizmów. Dzienna dawka białek powinna wynosić 0,5 - 0,7 g/kg ciała. W zależności od zapotrzebowania organizmu białka można podzielić na białka pełnowartościowe (zawierające wszystkie aminokwasy egzogenne np.: białka jaja kurzego, mleka, serów, mięsa, fasoli) i niepełnowartościowe (białka pozbawione jednego lub więcej aminokwasów egzogennych np.: białko kukurydzy, żelatyna).
Najlepiej wchłaniają się albuminy, które podobnie jak białka egzogenne są w 80% wchłaniane w dwunastnicy i przednim odcinku jelita czczego. Nie strawione białko dalej dostaje się do jelita grubego gdzie jest rozkładane przez enzymy bakteryjne i wydalane.
U noworodków może wchłaniać się niewielka ilość białek z pokarmu matki- w jelicie cienkim. Ma to duże znaczenie w przyswajaniu globulin mleka matki zawierających przeciwciała, których młody organizm nie umie jeszcze wytwarzać. Zapewnia to odporność bierną noworodków. Wchłanianie to trwa zwykle 36 - 48 h po porodzie, potem zanika.
Trawienie żołądkowe
W żołądku pod wpływem pepsyn białko rozpada się na mniejsze fragmenty oligopeptydowe. Częściowemu rozszczepieniu ulegają prawie wszystkie rodzaje białek pokarmowych z wyjątkiem protamin i keratyny. Sok żołądkowy dzięki dużej zawartości jonów wodorowych powoduje ponadto denaturację, uwodnienie i pęcznienie białek trudno strawnych (kolagen, keratyna, elastyna).
Powstające pod wpływem pepsyn polipeptydy mają masę cząsteczkową od 600 do 3000. Odszczepianie wolnych aminokwasów w żołądku zachodzi zbyt wolno i nie ma większego znaczenia.
Trawienie jelitowe
Mieszanina polipeptydów - produktów trawienia żołądkowego białek przechodzi następnie do jelit, gdzie ulega dalszemu rozkładowi na coraz mniejsze peptydy i aminokwasy. Dzieje się to głównie pod wpływem soku trzustkowego. Przyjmuje się, że końcowym produktem trawienia białek przez proteazy żołądkowe i trzustkowe są krótkie peptydy zwykle 2-6 aminokwasowe. Dalszy ciąg trawienia w świetle jelita stanowi ich hydroliza.
Wchłanianie peptydów
Aminokwasy występujące w treści jelitowej wchłaniają się głównie jako składowe małych peptydów. Wchłanianie aminokwasów jest procesem czynnym zachodzącym przeciw gradientowi chemicznemu. Transport aminokwasów przez śluzówkę jelitową wymaga nakładu energii. Wyróżnia się szereg układów transportujących aminokwasy przez błonę jelitową. Prawidłowo około 10% ilości białka w pokarmach wydalane jest w stolcu. W przypadku zaburzeń trawienia białek odsetek nie wchłoniętego białka wzrasta do 22-85%.
Choroby związane z zaburzeniami przemiany białek
Pierwotny niedobór białek ustrojowych występuje od urodzenia i stanowi anomalię dziedziczną, powoduje to zaburzenia gospodarki wodnej ustroju. Ze względu na brak globulin we krwi nie dochodzi do wytwarzania przeciwciał bakteryjnych.
Znacznie ważniejsze zagadnienie stanowią wtórne niedobory białkowe, których przyczynami są:
1. Niedobory spowodowane nadmiernymi stratami białek (przewód pokarmowy, nerki, skóra (oparzenia)).
2. Niedobory spowodowane zwiększonym rozpadem białek.
3. Niedobory powstałe na skutek niedostatecznej podaży w pożywieniu (choroba głodowa).
4. Niedobory spowodowane niedostatecznym lub nieprawidłowym wytwarzaniem białek, co związane jest ze stanami chorobowymi wątroby, trzustki, niedoborem aminokwasów.
Następstwami tych niedoborów są obrzęki, zaburzenia ciśnienia koloidalnego krwi, uszkodzenia naczyń krwionośnych, a w rezultacie upośledzenie czynności wszystkich narządów oraz upośledzenie gojenia się ran.
Nadmiar białek surowiczych jest dość rzadkim zjawiskiem. Wzrost poziomu białek następuje przeważnie wskutek tworzenia się białek szpiczakowych lub innych stanów chorobowych jak np. gościec stawowy, zapalenie płuc.
(Białka szpiczakowe - są to prawidłowe frakcje białkowe występujące w nadmiarze w wyniku zwyrodnienia poszczególnych klonów komórek immunologicznych. Ciekawym zjawiskiem fizyko-chemicznym związanym z nadmiarem białek szpiczakowych jest koagulacja białka Bence-Jonesa w moczu w temperaturze 52-60°C i upłynnienie go pod wpływem dalszego ogrzewania).
Roztwory właściwe a roztwory koloidalne
Roztwory właściwe są to jednorodne mieszaniny, których składniki zatraciły część swoich indywidualnych cech, w związku z czym stały się nierozróżnialne nawet przy dużych stężeniach. Wytwarzanie roztworów właściwych jest skutkiem dyfuzji, która występuje samorzutnie i zawsze przy zetknięciu się dwu różnych ciał np. soli i wody, wody i alkoholu, powietrza i wody. Rozdział roztworu właściwego na jego składniki nie może być przeprowadzony mechanicznie np. przez sączenie – lecz można go dokonać jedynie drogą procesów fizycznych np. przez odparowanie rozpuszczalnika, wykrystalizowanie ciała rozpuszczonego, rozdestylowanie par itp.
Ciało rozpuszczone w rozpuszczalniku powoduje w nim szereg zmian fizycznych, których podstawową cechą jest ciśnienie osmotyczne, zmiany temperatur krzepnięcia i wrzenia, obniżenie prężności pary itp.
Roztwory koloidalne (koloidowe), w przeciwieństwie do roztworów właściwych, mają następujące cechy:
1. niezdolność do dyfuzji ciała rozpuszczonego przez błonę półprzepuszczalną,
2. niezdolność do krystalizacji ciała rozpuszczonego,
3. zmniejszone ciśnienie osmotyczne nieraz do wartości prawie niedostrzegalnej.
4. charakterystyczne własności optyczne
Układ koloidowy jest to niejednorodny stan materii o określonym stopniu rozdrobnienia. Stan ten jest powszechny w przyrodzie ożywionej i nieożywionej.
Układ koloidowy utworzony jest z dwóch faz:
- fazy ciągłej – zwanej ośrodkiem rozpraszającym lub dyspersyjnym,
- fazy rozproszonej (zdyspergowanej).
Zarówno faza rozproszona, jak i rozpraszająca może występować w stanie stałym, ciekłym i gazowym. Charakterystyczną cechą układów koloidowych jest wielkość cząstek fazy rozproszonej mających wymiary 10-9– 10-7m. Układy o rozdrobnieniu większym są roztworami właściwymi, a o rozdrobnieniu mniejszym tworzą mieszaniny.
Biomedyczne znaczenie koloidów
Układami koloidowymi są roztwory wodne białek, tłuszczów i wielocukrów. Organizm ludzki jest złożonym – dynamicznym układem wielokoloidowym. Wszystkie płyny fizjologiczne, błony komórkowe, większość tkanek są koloidami. W ustroju zachodzą ciągle procesy koagulacji, peptyzacji, denaturacji, dyspersji zoli i żeli hydrofobowych. Istnieje stałe oczyszczanie zoli na drodze dializy, pęcznienie, sensybilizacja a także ochronne działanie koloidów.
W medycynie najważniejsze układy koloidowe to takie gdzie fazą rozpraszającą jest ciecz (woda) a fazą rozproszoną ciecz lub ciało stałe. Układy takie gdzie ośrodkiem rozpraszającym jest ciecz nazywamy zolami. Szczególne znaczenie ma podział zoli na liofobowe i liofilowe oparty na różnicach w solwatacji. Jeżeli zewnętrzna część cząsteczek zawiera cząsteczki rozpuszczalnika lub chętnie je adsorbuje, to koloid ma właściwości liofilowe, w przypadku wody – hydrofilowe, przejawiające się m.in. w tym, że można uzyskać duże stężenie fazy rozproszonej roztworu, a koloid łatwo tworzy galarety i pianę. Gdy zaś zewnętrzna warstwa cząsteczki koloidalnej jest utworzona z jonów jednego znaku, wówczas cząsteczki rozpuszczalnika nie adsorbują się, koloid ma właściwości liofobowe, w przypadku wody – hydrofobowe, maksymalne stężenie wodnego roztworu jest niewielkie, trudno tworzy (lub nie) galarety i pianę. Przykładem zoli hydrofobowych są wodne roztwory metali, siarki, a także AgCl, AgI, CaS, Al2O3, V2O5. Zole hydrofilowe to wodne roztwory białek, kwasów nukleinowych, skrobi, gumy arabskiej, kauczuku, niektórych barwników.
Koagulacja i peptyzacja
Koagulacja polega na łączeniu się cząstek koloidalnych w większe zespoły widziane gołym okiem. Skoagulowany koloid opada na dno naczynia i roztwór rozwarstwia się. Koagulacja może nastąpić na skutek zobojętnienia ładunku elektrycznego cząstek koloidalnych (punkt izoelektryczny), podwyższenia lub obniżenia temperatury, mechanicznych wstrząsów, odparowania lub wymrożenia rozpuszczalnika, dodatku elektrolitu i desolwatacji (proces wysalania). Koagulacja występuje także przy wzroście stężenia fazy zdyspergowanej. Roztwór koloidalny (zol) po koagulacji przechodzi w żel. Niektóre żele można ponownie przeprowadzić w zole. Taką koagulację nazywamy odwracalną a powstałe żele galaretami. Proces przejścia żelu w zol nazywany jest peptyzacją i może nastąpić na skutek dodania rozpuszczalnika, elektrolitu, wstrząsów mechanicznych (tiksotropia) lub podgrzania. Koagulacja koloidów liofilowych (np. białek) pod wpływem czynników bardziej drastycznych jak wysoka temperatura, stężone kwasy, zasady lub sole metali ciężkich nazywa się denaturacją. Proces ten jest nieodwracalny, gdyż produkt (żel) nie da się przeprowadzić w pierwotną formę zolu. Podczas denaturacji dochodzi do uszkodzenia struktury koloidu (dla białek zniszczenie zatem struktur IV, III i II rzędowej i utrata właściwości biochemicznych).
Własności optyczne koloidów
Układy koloidowe wykazują efekt Tyndalla. Promienie świetlne przechodzące przez zole ulegają rozproszeniu na skutek uginania się na cząsteczkach koloidalnych. Obserwuje się smugę świetlną zwaną stożkiem Tyndalla, która znaczy bieg strumienia świetlnego. W wyniku absorpcji światła roztwory koloidowe zwłaszcza liofobowe wykazują barwę. Na własnościach optycznych koloidów oparte są metody analizy ilościowej (nefelometria), pomiaru ciężaru cząsteczkowego i szybkości koagulacji.
Własności elektryczne
Wszystkie cząsteczki w koloidach liofobowych są naładowane elektrycznie na skutek selektywnej adsorpcji jonów elektrolitu z ośrodka rozpraszającego na cząsteczki koloidu. W koloidach liofilowych cząsteczki mogą być naładowane elektrycznie lub nie – źródłem ładunku jest dysocjacja kwasowa lub zasadowa cząsteczki. Między takimi cząstkami występują odpychające siły kulombowskie, które zapobiegają łączeniu się ich i koagulacji koloidu. Ładunek elektryczny będący jednym z warunków trwałości i stabilizacji koloidu powstaje na skutek:
1. jonizacji makrocząstek na makrojony,
2. adsorpcji jonów z roztworu na powierzchni cząstek koloidalnych.
Ładunek elektryczny można zobojętnić dodając odpowiednią ilość elektrolitu lub koloidu o znaku przeciwnym. Obojętne cząstki łączą się w większe zespoły na skutek działania sił van der Waalsa i następuje koagulacja.
Punkt izoelektryczny – jest to stan układu koloidowego, w którym średni ładunek nagromadzony na cząsteczkach koloidalnych jest równy zero. Po osiągnięciu punkty izoelektrycznego koloidy liofobowe natychmiast ulegają koagulacji.
Elektroforeza i elektroosmoza
Elektroforeza polega na wędrówce cząstek koloidalnych w polu elektrycznym. Cząstki naładowane dodatnio wędrują w kierunku katody (kataforeza), naładowane ujemnie w stronę anody (anaforeza). Poddając roztwór elektroforezie można określić znak ładunku cząstek koloidalnych. Różnice w prędkości cząstek w polu elektrycznym są podstawą metody elektroforetycznego rozdziału mieszanin koloidowych. Metodą tą można oznaczać frakcje białek surowicy krwi, oczyszczać enzymy, rozdzielać aminokwasy i polipeptydy. Procesom elektroforezy może towarzyszyć zjawisko elektroosmozy. Elektroosmoza polega na wędrówce rozpuszczalnika przez ośrodek kapilarny pod wpływem sił pola elektrycznego.
Własności mechaniczne
Koloidy wykazują ruchy Browna. W ciekłym lub gazowym środowisku dyspersyjnym cząstki koloidalne znajdują się w nieustannym ruchu postępowym, obrotowym i drgającym. Ruchy Browna stanowią jedną z najbardziej charakterystycznych cech koloidów. Bardzo wyraźne ruchy Browna, odpowiedzialne za samorzutną koagulację koloidu obserwuje się w koloidach liofobowych, nieznaczne zaś w koloidach liofilowych. Stężone roztwory koloidowe s...
chomiczkaAnka