mikro1.pdf

Podłoże biologiczne - mieszanina odpowiednio dobranych składników odżywczych,

dostarczających hodowanym na nich organizmom niezbędnych pierwiastków

chemicznych(C,H,N,P,S) oraz źródła energii . Każde podłoże musi mieć odpowiednią dla danego

gatunku wartość odżywczą, pH, potencjał oksydoredukcyjny (rH) oraz wartość osmotyczną,

dostępność tlenu . Ważne jest również określenie do jakiego celu ma służyć dane podłoże , czy

chodzi nam tylko o namnożenie komórek, czy o wyselekcjonowanie jakiegoś konkretnego

gatunku drobnoustroju, czy też o zróżnicowanie gatunków występujących w mieszaninie. Jednym

z koniecznych warunków, jaki muszą spełniać wszystkie podłoża jest ich sterylność , co oznacza, że

muszą być pozbawione wszelkich organizmów – zarówno ich form wegetatywnych jak i

przetrwalnych oraz przejrzystość.

Podziały podłoża biologicznego:

● zapotrzebowanie pokarmowe:

✔ minimalne- minimum pokarmowe, niekorzystne energetycznie, np. Davisa,

Fiedorowa(bezazotowe)

✔ pełne- wszystkiego w bród, np. Bulion odżywczy

✔ wzbogacone- dla organizmów o specyficznych upodobaniach(np. witaminy)

➢ skład chemiczny:

✔ naturalne-nieznany skład, np. Mleko

✔ półsyntetyczne- skład znany w połowie(podłoże minimalne+dodatki,których składu nie

znamy np. kazeina)

✔ syntetyczne- skład znany, podłoże minimalne+określone ilości określonych substancji

➢ konsystencja:

✔ płynne- brak czynników zestalającyh, np. Bulion odżywczy

✔ półpłynne-agar płynny(0,1-0,7%agaru), bakterie mogą go przerastać, do namnażania

bakteriofagów

✔ stałe-do wylewania na szalki(1,5-2% agaru)--> agar+bulion odżywczy=agar odżywczy

➢ zastosowanie

✔ namnażające-PŁYNNE, do otrzymywania dużej biomasy

✔ wybiórcze(selekcyjne)-STAŁE lub PŁYNNE, mają lub nie jakąś substancję

✔ namnażająco-wybiórcze-PŁYNNE, do określania dużej biomasie o określonej cesze

✔ różnicujące(elekcyjne)-do hodowania bakterii o wyróżniającej się cesze, STAŁE, np.

EMB

Źródła pierwiastków biogennych:

➢ N : NH 4 + , NO 3 - , NO 2 - , aminokwasy, N 2

➢ S : aminokwasy, siarczany

➢ C : cukry, CO 2

POŻYWKI:

➢ bulion odżywczy - do otrzymywania dużej biomasy, bogate, płynne

➢ agar - topnieje w ok.90 o C, krzepnie w ok. 40 O C, można go wielokrotnie używać,

uzyskiwany z krasnorostów, wielocukier wzbogacony MgSO 4 lub CaSO 4 . Nie dla każdej

bakterii.

➢ Żelatyna -rozpuszcza się w temperaturze 26-30 O C, krzepnie tylko raz, wiele bakterii ma

proteazy, które ją upłynniają

➢ krzemionka (żele krzemionkowe)- krzepnie tylko raz, bardzo twarde -->trudno posiać

bakterii [podłoże stałe bez substancji organicznych]

SPOSOBY PRZECHOWYWANIA BAKTERII:

✔ słupek- podłoże półpłynne

✔ szalka- podłoże stałe

WYJAŁAWIANIE:

➢ Autoklaw - hermetycznie zamknięty kocioł z podwójnym dnem, wrzącą parą wodną i

nadciśnieniem 1 atmosfery. Temperatura wzrasta do 121 o C na 15-30 minut. [agar, bulion

odżywczy, sól fizjologiczna, bufory, woda destylowana, narzędzia chirurgiczne, opatrunki]

➢ tyndalizacja - trzykrotne ogrzewanie jałowionego podłoża w temperaturze 100 o C przez 30

minut co 24 godziny. W czasie pierwszego ogrzewania zabite zostają formy wegetatywne, a

przetrwalniki zostają zaktywowane do kiełkowania, w wyniku działania wysokiej

temperatury i obecności pewnych związków orhanicznych. Proces ten jest możliwy dzięki

pozostawieniu jałowionego materiału w temperaturze pokojowej przez ok. 24 godziny.

Następne ogrzewanie zabija kiełkujące przetrwalniki( które utraciły ciepłooporność).

Trzecie ogrzewanie zabija ewentualne formy wegetatywne pozostałe po opóźnionym

kiełkowaniu. {stężone roztwory cukrów, witamin, aminokwasów itp]

➢ filtracja - jałowienie płynów, które ulegają rozkładowi pod wpływem ciepła(np. Roztwór

mocznika, surowica). Polega ona na przepuszczaniu jałowionego płynu przez filtr o

określonej wielkości porów zrobionego np. z octanu lub azotanu celulozy przy zastosowaniu

nad- lub podciśnienia. Filtr zatrzymuje bakterie na zasadzie mechanicznej i/lub fizyko-

chemicznej. Filtry i oprawki do filtrów należy przed użyciem wyjałowić(na ogół w

autoklawie); sterylne musi być także naczynie, do którego filtrujemy jałowy płyn.UWAGA:

podczas filtracji pozbywamy się bakterii ale nie WIRUSÓW!![bufory i inne roztwory,

których chcemy użyć natychmiast.]

➢ Promieniowanie : UV, γ, X[pomieszczenia, fartuch]

➢ Suszenie - jałowienie w wysokiej temperaturze bez udziału wody(pary wodnej).[szkło-160-

180 stopni C przez 1-1,5h]

➢ Środki chemiczne [blaty, pomieszczenia]- np. tlenek etylenu- zabija formy wegetatywne i

przetrwalnikowe(działa w min 5-15% obecniści wody)

✗ stężonych kwasów, zasad i soli nie trzeba jałowić- tam i tak nic nie wyrośnie.

Cechy umożliwiające bakteriom szerokie rozprzestrzenienie:

1) małe rozmiary

2) krótki czas generacji

3) różnorodność metaboliczna (zdolność do wykorzystania wielu źródeł węgla, azotu, energii,

różnych ostatecznych akceptorów elektronów)

4) zdolność adaptacji do zmieniających się warunków środowiska

5) zdolność do życia w warunkach ekstremalnych (dotyczy to temperatury, pH, potencjału

oksydo-redukcyjnego, ciśnienia osmotycznego, ciśnienia hydrostatycznego i bardzo niskich

stężeń substancji pokarmowych)

6) wytwarzanie form przetrwalnych

Środowiska życia bakterii:

➔ POWIETRZE:

✗ mało substancji odżywczych

✗ duża amplituda temperatur

✗ brak podłoża do przyczepu

✗ niewielka ilość dostępnej wody

✗ zanieczyszczenia

✗ promieniowanie UV- mutagen(obecność barwników karotenoidowych)

✔ duża dostępność tlenu

• po samym kolrze nie da się oznaczyć rodzaju bakterii

➔ GLEBA:

✗ dostępność tlenu zaledwie 30 cm wgłąb

✔ duża dostępność pokarmu

✔ dość dobra dostępność wody

• 2 typy flory:

○ mikroflora autochtoniczna- bakterie zawsze są w niej obecne

○ mikroflora zymogenna- bakterie pojawiają się okresowo

• zwykle brak barwników

➔ WODA:

✗ dostępność tlenu tylko przy powierzchni

✗ powierzchniowe warstwy narażone na działanie promieniowania UV

✔ duża dostępność wody

✔ duża dostępność pokarmu

✔ łatwe poruszanie

➔ ORGANIZMY ŻYWE- WARUNKI BARDZO RÓŻNE

Hodowla - podłoże z namnożonymi mikroorganizmami. Hodowle można prowadzić

na podłożu płynnym bądź stałym. Hodowle mogą być jednorodne (gdy na podłożu rośnie jeden

gatunek bakterii) lub mieszane (gdy rosną w nich przynajmniej dwa gatunki).

Kolonią- widoczne gołym okiem skupisko drobnoustrojów na podłożu stałym. Na ogół kolonia

powstaje w wyniku podziałów pojedynczej komórki

Czysta kultura- hodowla, w której bakterie stanowią potomstwo jednej, pierwotnie wyosobnionej

komórki bakteryjnej

Klon -czysta kultura i pochodzące od niej populacje bakteryjne.

Szczepy- różne klony należące do tego samego gatunku, a wyprowadzone z poszczególnych

czystych kultur, izolowanych niezależnie od siebie. W obrębie gatunku mogą więc występować

szczepy różniące się pewnymi cechami.

METODY OTRZYMYWANIA CZYSTYCH KULTUR:

➢ bezpośrednia- z wykorzystaniem mikromanipulatora

➢ seryjnych rożcieńczeń Listera

➢ posiew redukcyjny

➢ rozcieńczeń (0,1 ml, głaszcza- płytka mazana)

➢ płytki lane (gdy spodziewamy się niewielkiej ilości bakterii)

➢ replik(płytek odciskowych)

Liczba drobnoustrojów:

✔ w powietrzu

100

gdzie:

a - uśredniona liczba kolonii na płytce,

b - powierzchnia płytki w cm 2 ;

c - współczynnik czasu (dla 5 minut wynosi 1, dla 10 - 2, dla 15 - 3 itd.)

100 - przeliczenie powierzchni płytki na 100 cm 2

✔ w wodzie

X = a × b × 10 gdzie a - średnia liczba bakterii na płytkach;

b - odwrotność wysianego rozcieńczenia;

10 - przeliczenie na 1 ml (wysiewamy 0,1 ml).

HODOWLE:

OKRESOWA - po wsianiu bakterii

na odpowiednie podłoże płynne i

inkubowaniu ich w optymalnych dla

danego gatunku warunkach

następuje, po okresie adaptacji,

intensywny przyrost liczby bakterii

w hodowli. Jednakże skład podłoża

takiej hodowli podlega stopniowym

i ciągłym zmianom; ubożeje ono w

składniki pokarmowe, natomiast

nagromadzają się w nim metabolity,

wykazujące często działanie

toksyczne. Bakterie po okresie

intensywnego wzrostu, w którym

liczba komórek rośnie w postępie

geometrycznym, zaczynają się

dzielić coraz rzadziej, w wynika

czego hodowla wchodzi w fazę

równowagi a następnie w fazę

zamierania, w której podziały prawie zupełnie ustają, a liczba żywych komórek maleje.

CIĄGŁA - utrzymywanie hodowli w fazie intensywnego wzrostu przez dłuższy czas, ciągle

uzupełniając zużywane z podłoża składniki pokarmowe oraz odprowadzając z hodowli

nagromadzające się metabolity i nadmiar komórek.

SYNCHRONICZNA - kiedy stworzymy warunki do równoczesnego podziału wszystkich bakterii

w hodowli- odzwierciedla zachowanie się pojedynczej komórki i przez to może być przydatna w

wielu badaniach dotyczących fizjologii i genetyki bakterii.

TYPY WZROSTU:

➢ w hodowlach płynnych:

➢ dyfuzyjny (zmętnienie)

➢ w postaci kożuszka/ błonki

➢ w postaci osadu

➢ w hodowlach na pożywkach stałych(kolonie):

➢ wgłębne

➢ powierzchniowe

● gładkie

● szorstki

● śluzowe

➢ ruchliwe

PARAMETRY HODOWLI:

✔ STAŁA SZYBKOŚĆ PODZIAŁU - liczba podziałó na godzinę

✔ CZAS GENERACJI - czas od podziału do podziału(zależy od warunków)

✔ SWOISTA SZYBKOŚĆ WZROSTU - częstość podziału na jednostkę czasu(μ=1/g)

✔ CAŁKOWITY PRZYROST DROBNOUSTROJÓW - całkowity przyrost- stosunek ilości

komórek wprowadzonych do największej ilości.

LICZENIE BAKTERII:

• komora Thoma- liczba bakterii min 10 6

• filtry membranowe- mniejsza niż wyżej ilość bakterii

• metoda rozcieńczeń

• nefelometryczna- fotokomórka odczytująca ilość kolonii

• absorbancja(zmętnienie w czasie)

• licznik Coultera- określenie całkowitej liczby komórek-wykorzystuje przewodnictwo

elektrolitu

KSZTAŁTY BAKTERII:

ZIARNIAKI (COCCUS):

• dwoinki (diplo)

• pakiety

○ czworaki

○ sześciany np Micrococcus luteus

• łańcuszki (strepto) Strptococcus sp.

• gronkowce(staphylo) Staphylococcus sp.

■ podziały: prostopadłe, równoległe, oba

CYLINDRY:

• pałeczki Eschericha coli

• laseczki

○ tlenowe Bacillus sp.

○ Beztlenowe Clostridium sp.

SKRĘCONY CYLINDER:

• przecinkowce Vibrio, Enterobacteriaceae, Selenomonas sputigena- w jamie ustnej

• śrubowce Spirillium sp., Aquaspirillum sp.

• Krętki Borelia sp., Spirochaeta sp. Treponema sp.

SPOSOBY NA ZOBACZENIE BAKTERII POD MIKROSKOPEM:

• fluorescencja

• kontrast fazowy

• ciemne pole

• SEM

METODY BARWIENIA:

• pozytywne- bakterie kolorowe, reszta nie

• negatywne- reszta kolorowa, bakterie nie( np. Uwidacznianie otoczek)

• mieszane- wszystko kolorowe

Zwykle stosuje sie barwniki zasadowe( błękit metylowy, fuksyna zasadowa, fiolet krystaliczny,

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: