Apoptoza.doc

Apoptoza - połowa dwudziestego wieku - odkryto, że śmierć konieczna do eliminacji niektórych tkanek, aby inne mogły się rozwinąć - odkryto to w sześćdziesiątych latach.

Pierwsze białko proapoptotyczne pochodziło z Ceanorhabdidis elegans - Bcl9, a później odkryto homolog genu u człowieka - Bcl2. Ukoronowanie odktyć - 2002 nobel - genetyczna regulacja rozwoju organów i programowana śmierć komórkowa. Czy apoptoza jest tym samym, co PCD? W odniesieniu do zwierząt tak. Natomiast nie mówi się o apoptozie u roślin. Nekroza - niekontrolowana śmierć - wskutek czynników zapalnych - chemicznych, fizycznych. Ostatecznie prowadzi to do lizy komórki.

W tej chwili wiadomo ogólnie, że PCD jest stałe ewolucyjnie i geny u C. elegans są zbliżona pod względem budowy aż do człowieka. Proces konserwowany ewolucyjnie.

Podczas apoptozy - komórka się kurczy, wyrzucanie ciałek apoptotycznych. Jeśli się przyjrzeć prawidłowej komórce i apoptotycznej, to widać, że w morfologii jądra, którego chromatyna ulega kondensacji, zmiany w mitochondriach - zmiana przepuszczalności błon, zmiany w przepuszczalności błony cytoplazmatycznej - są to zmiany jednakże krokowe. Kończą się powstawaniem ciałek apoptotycznych, a więc odpączkowywaniem z komórki umierającej zawartości obłonionych. Jeśli patrzymy na morfologię komórek ulegających nekrozie, to o ile apoptotyczne się kurczą, to w nekrozie pęcznieją wskutek niekontrolowanej utraty przepuszczalności błon. Taka komórka puchnie, bo jest dziurawa i nabiera wody - dochodzi do jej dezintegracji i jej strawienia. W tej chwili jest szereg znanych białek, genów kodujących białka proapoptotyczne i antyapoptotyczne. Najbardziej znana z genów białek antyapoptotycznych jest funkcja genu Bcl2 i genu BAX i BAK, które kodują białko proapoptotyczne. Aby komórka kończyła swój żywot na drodze apoptozy potrzeba dużo ATP, odpowiedni potencjał utleniająco-redukcyjny, czyli czynniki do prawidłowej aktywności rozmaitych enzymów. Może wówczas dojść do ekspresji określonych genów, które produkują białka śmierci i części zmian biochemicznych... a więc kondensacja cytoplazmy, chromatyny, fragmentacja DNA, zmiana przepuszczalności mitochondrium, wywalenie cytochromu C i rozdziału komórki na ciałka apoptotyczne. W przeciwieństwie do apoptozy, czynniki, które prowadzą do nekrozy to czynniki mechaniczne i związki toksyczne. Dlaczego komórki ulegają apoptozie? Apoptoza jest normalnym procesem, który jest konieczny i do utrzymania odpowiedniej ilości komórej, normalnego rozwoju, zapobiegania infekcjom. Komórki ulegają apoptozie, żeby inne elementy mogły się rozwinąć. Takie przykłady to np.: resorpcja ogona kijanki podczas metamorfozy żaby - w określonym momencie rozwoju żaby ogon odpada - ale ten proces jest kontrolowany genetycznie i nie zachodzi dowolnie kiedykolwiek. Inne - zanikanie tkanki pomiędzy palcami u płodu. Apoptoza w jakimś sensie usuwa nadmiar komórek w trakcie rozwoju mózgu. Drugi motyw to konieczność stałęgo odtwarzania tkanek - jedne obumierają, inne się tworzą, np. krwi, czy nabłonkowe. III powód - niszczenie komórek, które zagrażają integralności organizmu. Może być śliska granica między nekrozą i apoptozą, bo pewne czynniki nekrotyczne mogą powodować apoptozę. Ale infekcja przez wirusy, czy pasożyty indukuje apoptozę. Przykład to niszczenie  komórek przez limfocyty T (gdy zainfekowane przez wirusy), czy też niszczenie komórek, gdzie uszkodzone DNA. Dlaczego? Bo dochodzi do intensywnej produkcji białka p53, które indukuje apoptozę. Jeśli dojdzie do uszkodzenia DNA, natychmiast silnie p53 się akumuluje, który dalej prowadzi  komórkę na ścieżkę apoptozy. Może być tak, że przy niskim poziomie uszkodzeń, komórka może wyjść z tego cyklu. Co się dzieje, gdy p53 jest zmutowane? Komórka nie może dojść do apoptozę, a wchodzi na drogę nowotworzenia i przekształca się w nowotworową. Generalnie o rozpoczęciu apoptozy może decydować to, że dojdzie do nadmiaru pewnych negatywnych sygnałów (np. wzrost ROS, czy kumulacji białek, które mają nieprawidłową strukturę przestrzenną) lub niedobór pozytywnych sygnałów - np. hormonów, to z kolei może także rozpocząć się apoptoza, a więc przyczyn bardzo wiele. Generalnie przebieg apoptozy wygląda tak, że może być ona regulowana przez tzw. szlak zewnętrzny receptorowy lub wewnętrzny. Po otrzymaniu sygnału zewnętrznego, dochodzi do uaktywniania kaspaz - proteaz cysteinowych, które mają własności proteolityczne i są istotnym białkiem apoptotycznym. Zwykle pewne kaspazy funkcjonują na początku, one uruchamiają kaspazy wykonawcze i dochodzi do apoptozy. Wewnętrzny szlak aktywacji jest zwany mitochondrialnym. Szlak zewnętrzny jest to taki, którego sygnały są odbierane przez receptory transbłonowe błony komórkowej, które należą do TNF - Tumor Necrotic Factor. Szlak wewnętrzny - sygnał odbierany od wewnątrz i powoduje zaburzenie potencjału transbłonowego mitochondium, zmianę przepuszczalności mitochondrium, wydostanie się rozmaitych białek - najważniejsze to cytochrom C i uruchomienie kaskady kaspaz. Tak więc porównując oba szlaki, to przynajmniej patrząc na to makroskopowo, główny schemat jest podobny - uruchamianie proteaz cysteinowych, które uruchamiają inne kaspazy i prowadzą do apoptozy. W zewnętrznym szlaku początek szlaku jest inny, bo albo są receptory transmembranowe  i one powodują powstanie kompleksu, który w sktócie nazywa się DISC - Death inducing signalling compleks -tworzenie liganda i receptora, jako kompleksu, który posiada domenę śmierci lub w przypadku wewnętrznego szlaku - zanim zostaje uruchomiona kaskada kaspaz, tworzy się struktura analogiczna do DISC ... apoptosom. Generalnie, jeśli patrzeć na te dwa schematy, to fazą wykonawczą są kaspazy.

Szlak zewnętrzny - ligand łączy się z receptorem FAS. Ligand rozpoznaje receptor i tworzy się DISC - w szczególnych przypadkach nosi nazwę FAD - FAS+domena śmierci. Dochodzi do aktywacji kaspazy ósmej, która stymuluje resztę kaspaz. Inny przykład receptora TNF - też tworzy DISC, który także aktywuje kaspazę 8 i to prowadzi do aktywacji kaskady kaspaz.

Szlak wewnętrzny - mitochondrialny. Jakiś sygnał wewnętrzny - może być to wzrost ROS, co indukuje zmiany na powierzchni błony mitochondrialnej. Znajduje się tam białko APAF1. Białko Apaf1 chronione jest zwykle poprzez jedno z białek antyapoptotycznych Bcl2. Jak się spojrzy na nie, to one współistnieją. Białko BCL2 chroni powierzchnię mitochondrium przed wniknięciem czynników do wnętrza mitochondrium. Jeżeli sygnał indukuje apoptozę, to sygnał ten zwykle powoduje rozsprzęgnięcie tych dwóch białek i oddalenie się białka Bcl2 i wobec tego swobodny białek proapoptotycznych do mitochondriów. Te białka - Bax i Bak wnikają do mitochondrium. One indukują zmiany potencjału transbłonowego mitochondrium, zwiększa się przepuszczalność i wypływ białek z przestrzeni międzybłonowej. Jednym z takich białek jest cytochrom C. Cyt c wskutek tej sekwencji zdarzeń wypływa do cytoplazmy i wraz z białkiem Apaf1 i kaspazą 9 tworzy apoptosom. Apoptosom jest pośrednim ogniwem aktywującym kaspazy. Często ta kaspaza jest w formie prokaspazy - nieaktywnej. Kaspaza 9 zostaje uruchomiona i cała reszta kaspaz zostaje uruchomiona i zaczyna się disco. Apoptosom jest strukturą o tyle ciekawą, że ma formę kołowej platformy i ma siedmiokrotną budowę - siedem monomerów. Oprócz tego jest prokaspaza 9 i cytochrom c - tworzy to strukturę przypominającą pogański manifest idei koła. Tworzenie apoptosomu jest krokowe - białko Apaf1 składa się z domen i ma sektory, które łączą się z innymi czynnikami, które tworzą apoptosom. Jedna domena łączy się z kaspazą, inna do cytochromu, a jeszcze inna indukuje proces oligomeryzacji. Najpierw przyłącza się cyt c i tworzy się monomer, która później jest siedmiokrotnie powielana - białko apaf1, cyt C i kaspaza 9. Budowa apoptosomu - są różne koncepcje. Wspólne jest to, że ma siedmiokrotną budowę. Istotna rzecz jest taka, że kaspazy to proteazy cysteinowe i występują w formie proenzymów w cytoplazmie. Znanych jest 14 kaspaz i to, co ważne, to to, że inna grupa tworzy kaspazy inicjujące, a inna grupa to kaspazy wykonawcze - czyli te, które powodują cięcia w białkach. To, co dobrze zapamiętać, to kaspazy inicjujące - w przypadku szlaku zewnętrznego, kaspazą inicjującą była kaspaza ósma. Natomiast w szlaku mitochondrialnym, to co wchodzi w skład apoptosomu, czyli struktury, która inicjuje aktywność kaspaz - (pro)kaspaza9. Zupełnie inne są aktywowane przez inicjujące - tu najlepiej są poznane kaspazy 3 i 6. W pozostałych przypadkach jest znak zapytania - do końca rola nieznana. Zupełnie inaczej są aktywowane kaspazy inicjatorowe i kaspazy egzekutorowe. W przypadku inicjatorowych, a więc 9-tej i ósmej, ich aktywacja zachodzi przez dimeryzację. Tworzenie dimerów powoduje aktywację. W przypadku kaspaz egzekutorowych - np. siódmej, czy 3 - są aktywowane inaczej...dzięki rozdziałowi na małą i dużą podjednostkę. A więc najpierw jest cięcie, które odcina, które odcina N-terminalny peptyd i dzieli kaspazę na małą i dużą podjednostkę. Jeśli patrzymy na część centralną szlaków, to kolejne aktywacje kaspaz - ósma uruchamia trzecią, dziewiąta siódmą. Uruchamiają się endonukleazy, które tną DNA itd. Istotnym elementem apoptozy jest fragmentacja DNA. Jednym z wyznaczników apoptozy jest specyficzna dla apoptozy internukleosomalna fragmentacja DNA - między nukleosomami - to odróżnia apoptozę od nekrozy, bo w nekrozie cięcia są przypakowe. W przypadku apoptozy, wszystko cięte przez specyficzne endonukleazy. JA kstwierdzić, że ta fragmentacja specyficzna? Szereg metod: jedna z nich to elektroforeza pojedynczych komórek, czyli nie całego ekstraktu, który się umieszcza na żelu i dochodzi do rozdziału faz, lecz pojedyncze komórki poddaje się elektroforezie na szkiełkach i patrzymy, czy jest fragmentacji. Jeżeli kuliste - komórka młoda, nie uległo nic fragmentacji. Jeżeli dostaniemy obraz przypominający kometę, to znaczy, że doszło do fragmentacji DNA. W nekrozie smiry. Można badać intensywność świecenia DNA - fluorochromu, którym się to barwi, jest proporcjonalna do zawartości DNA i można sprawdzić, jaka ilość została pofragmentowana.

Apoptoza może być wynikiem zakażeń wirusowych, bakteryjnych, pasożytniczych. W wielu wypadkach wirusy mogą indukować apoptozę, np. wirus HIV indukuje aktywność proapoptotyczną. HErpes virus wzmaga białka z grupy Bcl2 - nowotworzenie. W przypadku bakterii, niektóre uszkadzają błonę śluzową żołądka - Helicobacter pylori. Trypanosoma i Toxoplasma, wreszcie niektóre helminty.

PCD u roślin

wiadomo mniej, niż u zwierzątek. Nie używa się terminu apoptoza, dlatego, że z tego, co wiadomo, a gówno wiadomo, nie zawsze jest kontrola tych samych genów, które funkcjonują u zwierząt. Dlaczego tak jest? Jest inny rozwój roślin i zwierząt. Struktura i metabolizm też inne. W przypadku roślin, przynajmniej plastydy, wakuole i ściana komórkowa sprawiają, że metabolizm jest nieco różny. Trzeci argument... inna regulacja hormonalna. Tu przez fitohormony, a tam hormony innego typu. Nie stwierdzono homologów zarówno białek pro i antyapoptotycznych, ani nie znaleziono homologów kaspaz. Aczkolwiek są białka kaspazopodobne i białka Bcl2-podobne. Mają duży stopień homologii, ale nie są identyczne. To, co jest wspólne w obu procesach, to to, że są bardzo powszechne. I w trakcie rozwoju i odtarzania generacji komórek i reakcji na zakażenia i zareżanie funkcjonują te procesy także u roślin. A więc zarówno w fazie embrionalnej, jak i w organach generatywnych i wegetatywnych. Np. degeneracja megaspor, denegeracja tapetum (warstwa odżywcza ziaren pyłku) przykłady PCD. Inne przykłady - np. PCD elementów naczyniowych, czyli takich, którymi roślina przewodzi wodę, które początkowo mają normalne protoplasty, ale ostatecznie ich wnętrze zamiera i pozostaje ściana komórkowa i jest bardzo dobry przepływ pomiędzy poszczególnymi naczyniami. Są dwa wspólne wyznaczniki PCD i apoptozy - jeden z nich, to internukleosomalna fragmentacja DNA i która zachodzi u roślin również. Kondensacja chromatyny - dochodzi w określonym etapie do kondensacji. Internukleosomalna fragmentacja poprzedza fragmentacje chromatyny. Zmiany strukturalne jądra po to, aby pokazać, że chromatyna jest rozproszona, a później skondensowana... i wiadomo, o co chodzi. W liściu początkowo w jądrach rozproszona chromatyna, a w starych liściach są wyraźne elementy skondensowane. Liść o tyle fajną strukturą, że ma chloroplasty. Test kometkowy też można wykonać - im starszy liść, tym ten stopień fragmentacji większy. Poza tymi dwoma elementami, czyli fragmentacją DNA i kondensacją chromatyny jest pytanie - czy mitochondria biorą udział u roślin w indukcji PCD... otóż do końca niewiadomo. W kolejnych klatkach pokazywano mitochondria. Barwiąc mitochondria fluorochromami można sprawdzić jaki mają stan transbłonowy. Czerwony kolor - wysoki potencjał, zielony - niski. Występują zarówno populacje mitochondriów z zielonym i czerwonym... są więc i takie i takie formy na różnych etapach rozwoju. Wobec tego wniosek ostatecznie właściwie jest taki, że zarówno w młodych mitochondriach i starych są populacje z wysokim i niskim potencjałem, dlatego też można powiedzieć, że prawdopodobnie nie można mitochondrium traktować, jako ośrodka przekazywania sygnałów apoptotycznych...

PCD - co wiadomo, a czego nie? Wiadomo, że induktorem mogą być jak u zwierząt - zmiany rozwojowe i środowiskowe. Poziom ROS, metabolitów itd. Podobna internukleosomalna fragmentacja i kondensacja chromatyny. W chloroplastach fragmentacja chloroplastowego DNA i degradacja struktury. W mitochondriach - czy wypływ cytochromu c? niewiadomo. Znaleziono białka o dużym stopniu homologii do kaspaz, ale wciąż to nie są do końca kaspazy... a białka ANALOGICZNE.