GENOTERAPIA II
Komórki pnia – macierzyste.
Komórki macierzyste mają zdolność do podziałów, są pluripotentne, czyli mogą różnicować się w różne typy komórek. Komórki macierzyste dzielimy na zarodkowe, szpiku i tkanek.
Komórki macierzyste zarodkowe (ES – Embryonic stem cells) wyhodowano po raz pierwszy z bardzo wczesnych zarodków myszy, następnie chomika i małp człekokształtnych. Embrionalne komórki macierzyste człowieka wyhodowano w 1998 r. Ludzkie pierwotne komórki zarodkowe uzyskuje się dwoma metodami:
1. z komórek węzła zarodkowego blastocysty hodowanej in vitro
2. z listew płciowych i krezki grzbietowej jelita 5 – 9 tyg. poronionych płodów.
Blastocysta człowieka to zarodek dziesięciodniowy kształtu pęcherzyka, w którym część obwodową stanowią komórki trofoblastu, uczestniczące w wytworzeniu łożyska, a na biegunie komórki węzła zarodkowego rozwijają się w listki zarodkowe (ekto-, endo- i mezodermę). Z listków zarodkowych powstają odpowiednio wszystkie typy tkanek. Hodowlę izolowanych węzłów zarodkowych prowadzono w pożywce na warstwie inaktywowanych mysich fibroblastów płodowych. Komórki te otrzymuje się poprzez rozdrobnienie mysich tkanek płodowych traktowanych promieniami gamma w celu zahamowania ich podziałów. Dla komórek węzła zarodkowego pełnią one rolę podściółki mechanicznej i źródła czynników wzrostu. Pierwotne komórki zarodkowe, otrzymane z wczesnych, poronionych płodów ludzkich hoduje się na pożywkach zawierających również inaktywowane mysie płodowe fibroblasty wzbogacone w ludzki rekombinowany zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF).
Ludzkie komórki pierwotne, wywodzące się z obu źródeł (blastocysty i wczesnych płodów) wykazują silną aktywność fosfatazy zasadowej, co jest charakterystyczną cechą wszystkich znanych wcześniej komórek pierwotnych. Komórki pierwotne wywodzące się z blastocysty wykazują wysoką aktywność telomerazy (w komórkach wywodzących się z płodów aktywności tej nie sprawdzano).
Hodowlę in vitro komórek zarodkowych prowadzono przez rok i uzyskano z nich kilkaset kolonii. Średni czas podwajania populacji wynosił 35,3 godz. Kariotyp linii wyjściowej i linii klonalnej utrzymywał się bez zmian przez 12,5 miesiąca z jednym wyjątkiem (aberracja w 4 płytkach metafazalnych na 20). Po 6 miesiącach hodowli in vitro wstrzyknięto ponad 1 milion komórek klonalnych uzyskanych z węzła zarodkowego ludzkiej blastocysty do mięśni myszy z ciężkim niedoborem odporności. Sekcja myszy po 4 miesiącach wykazała obecność zarodkowych potworniaków zawierających tkanki z 3 listków zarodkowych (tkankę nerwową, mięśniową, chrząstkę, nerkę, nabłonek jelita).
Opisane badania potwierdziły zdolność pierwotnych komórek zarodkowych do proliferacji (namnażania) i diferencjacji (różnicowania) w różne tkanki przez rok hodowli in vitro (badania Thomson’a i Shamblott’a).
Hodowla pierwotnych komórek zarodkowych stwarza potencjalne możliwości uzyskiwania różnych rodzajów tkanek poprzez tzw. klonowanie terapeutyczne.
Klonowanie terapeutyczne polega na mikrochirurgicznym wprowadzeniu jądra komórki somatycznej dawcy do pozbawionego jądra oocytu biorcy (transplantacja jądra). Tak konstruowany zarodek hodowany jest in vitro do stadium blastocysty. Z blastocysty pobierane są komórki węzła zarodkowego i hodowane w celu uzyskania pierwotnych komórek macierzystych. Komórki te stymulowane odpowiednimi czynnikami różnicują się w potrzebną tkankę (ryc 1).
W październiku 2001 r. udało się dokonać pierwszej próby klonowania zarodka ludzkiego, w której uzyskano stadium 6 blastomerów (J.B. Cibelli, R.P. Lonco, M.D. West). Sklonowane ludzkie komórki zarodkowe mogą być wykorzystane do:
· tworzenia banków linii komórek pierwotnych reprezentujących szerokie spektrum alleli genów głównego układu zgodności tkankowej MHC, stwarzających możliwość dopasowania do biorcy
· tworzenia uniwersalnych linii dawczych pierwotnych komórek zarodkowych, w których geny MHC byłyby genetycznie zmienione tak, by nie wywoływać reakcji odrzucenia przeszczepu
· modyfikowania genetycznego linii pierwotnych komórek zarodkowych polegającego na wprowadzeniu genów głównego układu zgodności tkankowej potencjalnego biorcy
· produkowania na zamówienie linii zawierających genom potencjalnego biorcy (personalizacja linii)
Jednym ze sposobów byłoby klonowanie terapeutyczne, drugim – wprowadzanie jąder komórek biorcy do komórek zarodkowych istniejących już linii pozbawionych już jąder, a następnie namnażanie tych komórek. Metoda klonowania terapeutycznego daje nadzieję wyleczenia chorym na różne nieuleczalne choroby, ale stwarza istotne dylematy natury etycznej i prawnej. Obecnie w wielu krajach toczą się debaty na temat zakazu klonowania, nie tylko reprodukcyjnego ale również terapeutycznego.
Komórki macierzyste szpiku są nieliczne i występują w proporcji 1 : 100.000 w szpiku kostnym, a w krwi obwodowej 1 : 1 000.000 w stosunku do innych komórek jądrzastych. Mają one zdolność do podziałów mitotycznych przez całe życie człowieka i dlatego są uważane za nieśmiertelne. Komórki macierzyste krwinek nie są odróżnialne na podstawie morfologii od innych komórek szeregu rozwojowego. Identyfikuje się je przy użyciu testów czynnościowych in vitro i in vivo.
Test in vitro polega na zdolności komórek macierzystych do tworzenia kolonii komórkowych w półpłynnym agarze.
Test in vivo polega na podjęciu hemopoezy po podaniu komórek macierzystych przez organizm pozbawiony wcześniej własnych komórek krwiotwórczych. Do odtworzenia krwinek i układu krwiotwórczego wystarczy zaledwie 100 komórek macierzystych. Obecne w szpiku komórki macierzyste można zagęszczać we krwi na podstawie ich właściwości antygenowych – wiążą przeciwciała na białko CD34. Zagęszczenie komórek macierzystych we krwi w dostatecznej do transfuzji ilości jest czasochłonne i wymaga dziesięciu sześciogodzinnych sesji. W badaniach doświadczalnych stosuje się różne metody izolowania komórek macierzystych krwi:
· izolacja metodą rozcieńczeń granicznych
· użycie tiocyjanu
· sortowanie komórek wiążących przeciwciała na wybrane antygeny powierzchniowe w cytometrze przepływowym
· izolowanie komórek przez immuno-usunięcie innych komórek
Wiadomo obecnie, że komórki macierzyste szpiku kostnego mogą różnicować się w komórki innych tkanek i należy je traktować jako komórki multipotentne. Badania prowadzone w ostatnich latach na komórkach macierzystych szpiku kostnego szczurów i człowieka wykazały, że roztwór o odmiennym składzie pożywki spowodował, że aż 80% komórek utworzyło wypustki podobne do istniejących w neuronach jak również uczynniły się niektóre białka obecne w komórkach nerwowych – komórki dendrytyczne.
Niektóre komórki zrębu szpiku, mezenchymatyczne komórki macierzyste mają zdolność samoodnawiania oraz różnicowania w komórki krwiotwórcze i komórki zrębu.>
Klon takiej komórki może wytworzyć in vitro liczne typy tkanki łącznej (komórki kości, chrząstki, tłuszczowe). Po przeszczepieniu tych komórek transgenicznym myszom z osteogenesis imperfecta (niewłaściwym kostnieniu) znajdowano DNA komórek dawcy w tkance kostnej, chrzęstnej i w płucach biorcy.
Bogatym źródłem komórek hemopoetycznych (macierzystych szpiku) jest krew pępowinowa. Komórki macierzyste zawarte we krwi pępowinowej różnią się pod względem antygenowym od szpiku osób dorosłych i są lepiej tolerowane przez biorców. By dokonać transplantacji szpiku należy dopasować 6 z 12 antygenów układu HLA (Human Leucocyte Antigenes). Zespół genów HLA znajduje się na chromosomie 6. W przypadku krwi pępowinowej ze względu na niedojrzałość komórek macierzystych w porównaniu z komórkami macierzystymi szpiku kostnego możliwe jest dokonanie przeszczepu zgodnego pod względem 5, a nawet 3 antygenów.
Obecnie krew pępowinową stosuje się u chorych z anemią sierpowatą, niedoborami odporności, enzymopatiami, np. w zespole Hurler – postępującej degeneracji neuronów prowadzącej do śmierci. W tym ostatnim przypadku komórki macierzyste z krwi pępowinowej mogą być źródłem komórek mikrogleju w mózgu dostarczających brakujących tam enzymów.
Obecnie istnieją na całym świecie banki krwi pępowinowej, w tym 3 w Polsce.
Przeszczep krwi pępowinowej wiąże się jednak z pewnym ryzykiem, że przeszczepiane komórki mogą być uszkodzone genetycznie i mogą spowodować chorobę biorcy np. ciężki niedobór odporności. Postęp biotechnologii pozwoli w najbliższym czasie na modyfikowanie krwi pępowinowej poprzez terapię genową.
Komórki macierzyste tkanek występują wśród komórek tkanki, którą odnawiają. Komórki macierzyste mogą być unipotentne jak na przykład komórki macierzyste – spermatogonie, które odpowiadają za ciągła produkcję plemników lub multipotentne, takie jak komórki macierzyste tkanki nerwowej lub krwi. Komórki macierzyste nerwowe dają początek neuronom i 2 typom komórek glejowych, a komórki macierzyste krwi wszystkim rodzajom krwinek. Komórki macierzyste tkanek są niezróżnicowane i odpowiednio dostosowane do swoich nisz tkankowych. Komórki macierzyste nabłonków zajmują określoną pozycję w tkance, np. w krypcie jelitowej leżą u podstawy, a zróżnicowane enterocyty w górnej części krypty i w kosmkach.
Coraz częściej prowadzone są poszukiwania komórek macierzystych w narządach szczególnie interesujących ze względów medycznych. Stosując analizę klonową komórek nabłonkowych ludzkiego gruczołu krokowego (prostata) in vitro wyodrębniono populację komórek o wysokim wskaźniku proliferacji i różnicowania czyli komórki macierzyste nabłonka prostaty. Podobnie udało się uzyskać multipotentne komórki trzustki. W hodowli tych komórek in vitro uzyskano zdolność do ekspresji czynnika transkrypcyjnego IPF-1 (Insulin Promoter Factor 1), co uznano za dowód właściwości komórek macierzystych.
Transdyferencjacja.
W badaniach ostatnich lat stwierdzono, że komórki macierzyste tkanek po ich zagęszczeniu i przeszczepieniu do biorcy mogą różnicować się nie tylko w tkankę, z której pochodzą, ale także w inne tkanki pochodzące nawet z innych listków zarodkowych. Proces taki nazywamy transdyferencjacją.
W doświadczeniach na myszach udowodniono, że komórki przeszczepionego szpiku różnicowały się w neurony, astrocyty i komórki mikrogleju.
Komórki macierzyste mięśni i krwi mogą wzajemnie dawać obie tkanki. Napromieniowanym myszom przeszczepiono komórki mięśniowe, które po 6 tygodniach utworzyły średnio 56% krwi obwodowej, co oznaczało, że ich aktywność krwiotwórcza była 10-krotnie wyższa niż komórek szpiku. Z kolei komórki macierzyste szpiku transplantowane myszom z dystrofią mięśniową po 12 tygodniach wytwarzały 4% włókien mięśniowych rozpoznawalnych na podstawie zawartości dystrofiny typu dzikiego.
Wykazano również doświadczalnie, że mysie i szczurze komórki krwiotwórcze mogą różnicować się w hepatocyty (komórki wątrobowe).
W badaniach na ludzkim materiale sekcyjnym u kobiet z przeszczepionym szpikiem pochodzącym od dawców płci męskiej (wykorzystując chromosom Y jako marker wprowadzonych komórek) stwierdzono, że liczne hepatocyty i holangiocyty pochodzą z przeszczepionych komórek. Oznacza to, że komórki macierzyste szpiku uczestniczyły w regeneracji wątroby.
W innych doświadczeniach na myszach stwierdzono, że komórki macierzyste układu odpornościowego mogą róznicować się w mięśnie, jelito, wątrobę lub krew.
Transdyferencjacja komórek macierzystych tkanek może być związana ze środowiskiem w jakim się znajdują, zgodnie z teorią nisz. Zjawisko transdyferencjacji może być wykorzystane do autoprzeszczepów hodowanych komórek macierzystych (ryc 2).
Autoprzeszczepy hodowanych komórek macierzystych mogłyby mieć następujące zastosowanie medyczne:
· wykorzystanie komórek macierzystych i otrzymanych z nich in vitro tkanek do transplantacji i komórkowych terapii zastępczych
· manipulacje macierzystymi komórkami krwi występującymi w szpiku, którego przeszczepy wykonuje się między innymi pacjentom z białaczkami
· hodowla skóry i przeszczepy pacjentom z oparzeniami
· otrzymywanie komórek produkujących insulinę i przeszczepianie ich pacjentom z cukrzycą
· przeszczepianie komórek macierzystych układu nerwowego pacjentom ze schorzeniami mózgu
· produkcja nowych neuronów dla pacjentów z chorobą Parkinsona
ludi.lg