12_Wieczorek.pdf

YWNO . Nauka. Technologia. Jako , 2005, 4 (45) Supl., 132 – 138

KINGA WIECZOREK, JACEK OSEK

PRZYDATNO WYBRANYCH TECHNIK PCR W RÓ NICOWANIU

TERMOTOLERANCYJNYCH SZCZEPÓW CAMPYLOBACTER

S t r e s z c z e n i e

Campylobacter spp. nale y do najcz stszych bakteryjnych czynników etiologicznych infekcji

pokarmowych u ludzi. Główn przyczyn zaka e człowieka tymi drobnoustrojami jest spo ywanie

niedogotowanego mi sa drobiowego, ska onej wody oraz niepasteryzowanych produktów mlecznych. W

badaniach epidemiologicznych wykorzystywane s molekularne metody ró nicuj ce, które umo liwiaj

analiz pokrewie stwa genotypowego mi dzy izolatami nale cymi do rodzaju Campylobacter ,

wyosobnionymi z tego samego lub z ró nych ródeł. Jedna z nich - ERIC-PCR (Enterobacterial

Repetitive Intergenic Consensus – Polymerase Chain Reaction) polega na zastosowaniu w reakcji

amplifikacji starterów o długich sekwencjach nukleotydowych, komplementarnych do konserwatywnych

fragmentów obecnych w genomie drobnoustrojów rodziny Enterobacteriaceae, jednak ró nie w nim

rozmieszczonych w zale no ci do gatunku lub szczepu bakteryjnego. ERIC-PCR umo liwia szybkie

ró nicowanie izolatów i stanowi przydatne narz dzie słu ce do analizy genomu prokariotycznego. W

ostatnich latach do molekularnego typowania Campylobacter , zwłaszcza C. jejuni i C. coli , stosowana jest

analiza długo ci fragmentów restrykcyjnych (RFLP) amplifikowanego technik PCR genu flaA. Metoda

ta cz sto jest równie wykorzystywana w badaniach epidemiologicznych.

Celem bada było okre lenie przydatno ci technik PCR-RFLP i ERIC-PCR do molekularnego

ró nicowania szczepów Campylobacter izolowanych z tuszek drobiowych. W wyniku analizy PCR-RFLP

otrzymano 5 profili restrykcyjnych, składaj cych si z szeregu fragmentów DNA o ró nych masach

molekularnych. Natomiast test ERIC-PCR pozwolił na otrzymanie 6 profili molekularnych. Uzyskane

rezultaty wskazuj na stosukowo du zdolno ró nicowania obu zastosowanych w pracy metod oraz ich

przydatno do genotypowego zró nicowania szczepów C. jejuni i C. coli.

Słowa kluczowe: Campylobacter , ró nicowanie, flaA typowanie, PCR-RFLP, ERIC-PCR

Wprowadzenie

Campylobacter spp. nale y do najcz stszych czynników etiologicznych infekcji

pokarmowych wywołanych spo yciem ska onej ywno ci. Z powodu szerokiego

wyst powania tych bakterii w populacji zwierz cej istnieje du e ryzyko ska enia

produktów ywno ciowych, takich jak: surowe mi so i mleko, a tak e

Mgr K. Wieczorek, prof. dr hab. J. Osek, Zakład Higieny ywno ci Pochodzenia Zwierz cego,

Pa stwowy Instytut Weterynaryjny – Pa stwowy Instytut Badawczy, Al. Partyzantów 57, 24-100

Puławy, e-mail: kinga.wieczorek@piwet.pulawy.pl

PRZYDATNO WYBRANYCH TECHNIK PCR W RÓ NICOWANIU TERMOTOLERANCYJNYCH...

133

niepasteryzowane produkty mleczne oraz woda. Główn przyczyn zaka e człowieka

jest jednak mi so drobiowe [12]. Prawidłow identyfikacj i ró nicowanie bakterii

nale cych do rodzaju Campylobacter metodami mikrobiologicznymi utrudnia m.in.

du a zmienno tych drobnoustrojów i ich specyficzne wymagania wzrostowe.

Dodatkowo, stosunkowo cz sto wyst puj szczepy atypowe biochemicznie.

Atrakcyjn alternatyw dla bada fenotypowych s obecnie metody wykorzystuj ce

techniki biologii molekularnej. Ró nicowanie bakterii nale cych do rodzaju

Campylobacter mo liwe jest przy zastosowaniu metod genotypowych obejmuj cych

m.in. analiz polimorfizmu długo ci fragmentów restrykcyjnych (RFLP), równie w

poł czeniu z elektroforez pulsacyjn (PFGE), a tak e analiz polimorfizmu

przypadkowo amplifikowanego DNA (AP-PCR) [13]. Jedna z technik powielania

powtórzonych fragmentów DNA - ERIC-PCR (Enterobacterial Repetetive Intergenic

Consensus) polega na zastosowaniu w reakcji PCR długich starterów nukleotydowych

komplementarnych do sekwencji konserwatywnych w genomie rodziny

Enterobacteriaceae, jednak ró nie w nim rozmieszczonych w zale no ci od gatunku

lub szczepu [6]. Inn z powszechniej u ywanych metod ró nicowania C. jejuni i C.

coli jest typowanie przy u yciu analizy polimorfizmu długo ci fragmentów

restrykcyjnych (RFLP) amplifikowanego technik PCR genu flaA (koduj cego

ekspresj białka flageliny). W wyniku działania enzymu restrykcyjnego (najcz ciej

jest to Dde I) powstaje swoisty dla ka dego drobnoustroju układ amplikonów o ró nych

masach molekularnych, na podstawie którego mo na specyficznie ró nicowa szczepy

Campylobacter obu gatunków [1, 9].

Celem pracy było okre lenie przydatno ci dwóch technik molekularnych: PCR-

RFLP ( flaA ) oraz ERIC-PCR w ró nicowaniu izolatów Campylobacter pochodz cych

z tuszek drobiowych.

Materiał i metody bada

Szczepy bakteryjne

W badaniach wykorzystano szczepy referencyjne: C. jejuni ATCC 33291 i C. coli

ATCC 43478, oraz po 5 izolatów C. jejuni i C. coli pochodz cych z tuszek

drobiowych. Wymazy, z których pozyskano izolaty, pochodziły z jednego zakładu

produkcyjnego i zostały pobrane jednego dnia. Bakterie klasyfikowano do rodzaju

Campylobacter przy u yciu metody mikrobiologicznej wg PN-ISO 10272 [10].

Przynale no gatunkow wyosobnionych drobnoustrojów okre lano stosuj c test

multiplex PCR [2].

Matrycowy DNA

Bakteryjne DNA otrzymano z pojedynczych kolonii Campylobacter spp.

inkubowanych na po ywce Karmali (Oxoid) przez 24 h w temp. 42°C w warunkach

mikroaerofilnych. Bakterie zawieszano w 1 ml wody redestylowanej i odwirowywano

13 000 g przez 1 min. Do uzyskanego osadu dodawano 100 µl 10 mM buforu Tris, a

134

Kinga Wieczorek, Jacek Osek

nast pnie izolowano DNA za pomoc zestawu Genomic – Mini (A&A Biotechnology

Gda sk) zgodnie z instrukcj podan przez producenta. Czysto i koncentracj

uzyskanego DNA oznaczano spektrofotometrycznie i w odpowiednim rozcie czeniu

stosowano w testach PCR.

Test PCR-RFLP

Amplifikacje przeprowadzono w mieszaninie reakcyjnej zawieraj cej startery

flaAF (5’ GGATTTCGTATTAACACAAATGGTGC 3’) i flaAR (5’

CTGTAGTAATCTTAAA CAT TTTG 3’) (IBB, Polska) [http://campynet.vetinst.dk]

w st eniach 0,1 µM, matrycowy DNA o koncentracji 20 ng/µl (5 µl), 5 mM MgCl 2 ,

dNTP (200 µM), 2 U polimerazy Taq (Fermentas, Litwa). Reakcje wykonywano

u ywaj c programu o nast puj cych parametrach: temp. 94°C – 5 min, a nast pnie 30

cykli: 94°C – 1 min, 48°C – 1 min, 72°C – 2 min. oraz 72°C – 5 min. Produkt

amplifikacji o masie 1700 pz poddawano działaniu enzymu restrykcyjnego Dde I (2 U)

w temp. 37°C przez 3 h, wykonywano elektroforez w 2% elu agarozowym

barwionym bromkiem etydyny o st eniu 5 µg/ml przez 1 min, a nast pnie ogl dano w

wietle UV przy u yciu zestawu Gel-Doc 2000 (Bio-Rad, USA). Do okre lenia

wielko ci uzyskanych pr ków zastosowano marker masy molekularnej Gene Ruler

100 bp DNA Ladder Plus firmy Fermentas o nast puj cym rozkładzie pr ków – 100,

200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031, 1200, 1500, 200, 3000.

Test ERIC-PCR

Przeprowadzano go w mieszaninie reakcyjnej o ko cowej obj to ci 50 µl,

zawieraj cej: 5 mM MgCl 2, dNTP (200 µM), bufor enzymatyczny, 2 U termostabilnej

polimerazy Taq (Fermentas), startery: ERIC 1-R (5’ ATGTAAGCTCCTGGGATCAC

3’) i ERIC 2 (5’ AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3’) [14] oraz matrycowy DNA

o koncentracji 10 ng/µl (5 µl). Reakcje wykonano stosuj c program o nast puj cych

parametrach: temp. 94°C – 4 min (denaturacja wst pna), a nast pnie 40 cykli: 94°C –

45 s, 25°C – 45 s, 72°C – 1 min. Ko cowy etap wydłu ania przeprowadzono w temp.

72°C przez 5 min. Otrzymane produkty amplifikacji identyfikowano w 1,7% elu

agarozowym [3, 8].

Wyniki i dyskusja

Typowanie szczepów bakteryjnych jest szczególnie wa ne ze wzgl dów

epidemiologicznych. Umo liwia precyzyjne okre lenie ródła zaka enia oraz dróg

szerzenia si patogenów. Bior c powy sze pod uwag niezb dne jest opracowanie

techniki, która charakteryzowałaby si du zdolno ci ró nicowania, powtarzalno ci

uzyskiwanych wyników, a tak e łatwo ci wykonania. W obecnej pracy do oceny

zdolno ci ró nicowania izolatów Campylobacter wybrano dwie techniki – PCR-RFLP

oraz ERIC-PCR. W celu ustalenia warunków analizy wykorzystano DNA pochodz ce

ze szczepów referencyjnych C. jejuni i C. coli . Przeprowadzono szereg reakcji z

ró nymi koncentracjami matrycowego DNA, zmieniano równie temperatur

PRZYDATNO WYBRANYCH TECHNIK PCR W RÓ NICOWANIU TERMOTOLERANCYJNYCH...

135

przył czania starterów oraz st enie jonów magnezu. Wynik ka dorazowo oceniano na

elu agarozowym i w przypadku techniki ERIC-PCR wybierano takie st enia

reagentów i parametry amplifikacji, które dawały najwi ksz liczb wyra nych,

powtarzalnych produktów amplifikacji. Testy te u yto nast pnie do oceny izolatów

pochodz cych z tuszek drobiowych. W przypadku techniki PCR-RFLP w pierwszym

etapie pracy otrzymano produkt amplifikacji genu flaA (1700 pz), który nast pnie

poddano działaniu enzymu restrykcyjnego Dde I. W rezultacie otrzymano 3 ró ne

profile w odniesieniu do szczepów C. jejuni i 2 – C. coli, na które składały si

fragmenty o masach molekularnych od ok. 120 – 900 pz, stanowi cych podstaw do

genotypowego ró nicowania badanych szczepów Campylobacter (fot. 1). W kolejnym

etapie bada wykonano test ERIC-PCR z u yciem tych samych 10 izolatów

pochodz cych z tuszek drobiowych. Otrzymano 6 profili molekularnych (po 3 w

obr bie C. jejuni i C. coli ), na które składały si od 4 do 8 amplikonów o masach od

100 do ponad 2000 pz (fot. 2).

Wyniki powy szych bada , w odniesieniu do techniki PCR-RFLP, s zgodne z

doniesieniami innych autorów, którzy równie dobrze oceniaj zdolno ró nicowania

tej metody w odniesieniu do szczepów Campylobacter , zwłaszcza C. jejuni i C. coli.

Analiza ta jest obecnie szeroko rozpowszechniona w typowaniu tych drobnoustrojów

pochodz cych z ró nych ródeł. Jest to zwi zane z potwierdzeniem w wielu

do wiadczeniach jej wysokiej zdolno ci ró nicowania i powtarzalno ci uzyskiwanych

wyników, co w poł czeniu z innymi cechami, takimi jak szybko i łatwo wykonania

analizy oraz stosunkowo niskie koszty sprawia, e jest to obecnie jedna z bardziej

przydatnych technik molekularnych słu cych do ró nicowania bakterii nale cych do

rodzaju Campylobacte r [1, 4, 5].

W obecnej pracy uzyskano równie zadowalaj ce rezultaty w odniesieniu do testu

ERIC-PCR. Jednak jest on stosunkowo rzadko u ywany do ró nicowania tej grupy

drobnoustrojów z uwagi na pewne ograniczenia zwi zane z relatywnie nisk

powtarzalno ci wyników, na któr du y wpływ maj stosowane w ró nych

laboratoriach warunki amplifikacji. W zwi zku z tym, przy wykorzystaniu tej techniki

w badaniach epidemiologicznych nale y zwróci szczególn uwag na ujednolicony

sposób prowadzenia do wiadcze [7, 11].

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

136

Kinga Wieczorek, Jacek Osek

500 pz

Fot. 1. Profile PCR-RFLP szczepów Campylobacter . Poszczególne cie ki: 1–5 szczepy C. jejuni , 6–10

szczepy C. coli, M – 100 pz marker masy molekularnej.

Phot. 1. PCR - RFLP profiles of Campylobacter strains. Individual Lanes: 1–5 C. jejuni strains, 6–10 C.

coli strains, Lane M – 100 bp marker of the molecular mass (DNA ladder).

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

500 pz

Fot. 2. Obraz elektroforetyczny produktów amplifikacji testu ERIC-PCR otrzymanych z DNA szczepów

Campylobacter . Poszczególne cie ki 1–5 C. jejuni, 6–8 C. coli, M – 100 pz marker masy molekularnej.

Phot. 2. Agarose gel electrophoresis showing ERIC-PCR fingerprintings generated by Campylobacter

strains. Individual Lanes: 1–5 C. jejuni strains; 6–10 C. coli strains; Lane M – 100 bp marker of the

molecular mass (DNA ladder) .

Wnioski

1. Stosowane w pracy techniki ERIC-PCR i PCR-RFLP charakteryzuj si du

zdolno ci genotypowego ró nicowania drobnoustrojów nale cych do rodzaju

Campylobacter .

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: