SPIS TREŚCI
I. WSTĘP I RYS HISTORYCZNY (w skrócie) 1
I.1. Definicja i przedmiot badań 1
I.2. Rys historyczny 2
I.3. Działy mikrobiologii 11
I.4. Kalendarium 19
II. LABORATORIUM MIKROBIOLOGICZNE 60
II.1. ZASADY BEZPIECZNEJ PRACY W LABORATORIUM 62
MIKROBIOLOGICZNYM 63
II.2. WYPOSAŻENIE LABORATORIUM MIKROBIOLOGICZNEGO 85
2.1. Podstawowa aparatura mikrobiologiczna 87
2.2. Drobny sprzęt i szkło laboratoryjne 139
2.3. Zadania 160
II.3. METODY JAŁOWIENIA 167
3.1. Metody fizyczne 174
3.2. Metody mechaniczne 217
3.3. Metody chemiczne 222
3.4. Zadania 232
II.4. WARUNKI HODOWLI MIKROORGANIZMÓW 254
4.1. Temperatura 261
4.2. Tlenowość - potencjał oksydacyjno-redukcyjny 274
4.3. Kwasowość - odczyn środowiska 298
4.4. Składniki odżywcze 313
4.5. Przygotowywanie pożywek 395
4.6. Zadania 401
II.5. TECHNIKA WYKONYWANIA POSIEWÓW 444
5.1. Pobór materiału i przygotowanie do posiewu 455
5.2. Technika posiewów 489
5.3. Posiew ilościowy 522
5.4. Izolacja czystych kultur 526
5.5. Rozcieńczalniki stosowane do przygotowywania zawiesin 539
5.6. Zadania 546
II.6. WZROST DROBNOUSTROJÓW NA PODŁOŻACH 566
6.1 Wzrost i rozmnażanie się pojedynczej komórki 572
6.2. Wzrost liczebności całej populacji 581
6.3. Charakterystyka wzrostu mikroorganizmów na pożywkach 596
6.4. Metody oznaczania liczby drobnoustrojów 677
6.5. Zadania 739
II.7. MIKROSKOP I PRZYGOTOWANIE PREPARATÓW 769
DO OBSERWACJI MIKROSKOPOWYCH 770
7.1. Mikroskop 776
7.2. Technika wykonania preparatów mikroskopowych 808
7.3. Określanie wielkości mikroorganizmów 887
7.4. Zadania 902
LITERATURA 919
MIKROBIOLOGIA – „micros; bios; logos” podobnie jak botanika i zoologia, jest działem biologii – nauki o życiu małych organizmów. Encyklopedia multimedialna PWN określa mikrobiologię jako „naukę o budowie, czynnościach i roli w przyrodzie (gospodarce) drobnoustrojów”.
Przedmiotem badań mikrobiologii są zatem drobnoustroje (mikroorganizmy). Są to „niższe organizmy o mikroskopowych wymiarach, np. bakterie i zbliżone do nich organizmy, wirusy, niektóre glony, grzyby, pierwotniaki; mają olbrzymie znaczenie w przyrodzie”. Niewielkie wymiary komórki nie są jednak jedynym atrybutem drobnoustrojów. Określenie „mikroorganizm” nawiązuje także do metod badawczych, jakie wykorzystujemy w badaniach tych organizmów. W miarę pełna definicja charakteryzuje mikroorganizmy jako:
· wszędobylskie organizmy mikroskopijnej wielkości, mierzonej w mikrometrach (µm – 1/1000 mm) lub w nanometrach (nm - 1/1000 µm), których badanie jest możliwe za pomocą metod mikrobiologicznych, miedzy innymi mikroskopowych;
· organizmy jednokomórkowe lub tworzące układy komórek, lecz nie mające struktury tkankowej, przy czym każda z komórek charakteryzuje się pełną autonomią.
Drobne rozmiary tej grupy organizmów sprawiały, że przez długi czas były one nieznane i niewidoczne. Ich poznanie było bowiem uzależnione od postępu w zakresie metod i technik badawczych, zwłaszcza mikroskopii, biochemii i genetyki. Drobnoustroje występujące w środowisku człowieka były jednak już u zarania dziejów przez ludzkość wykorzystywane, np. do sporządzania piwa i wina, kwaszenia mleka i warzyw, wypieku ciast. Powodowały także niekorzystne zjawiska (choroby roślin, zwierząt i człowieka, psucie się żywności).
Pierwsze wzmianki o chorobach spotyka się już w najstarszych źródłach. Są to zapiski chińskie i indyjskie (XX i X w p.n.e., ospa); o wściekliźnie wspomina kodeks Esznana w Babilonii, a o gruźlicy i malarii donosi HIPOKRATES – ojciec medycyny greckiej. Pojawiają się przypuszczenia, że w otoczeniu człowieka występują nieznane czynniki odpowiedzialne za dotąd niewytłumaczalne zjawiska (Varro, Columella I / II w p.n.e). Również w Biblii, w księdze „Leviticus” jest wzmianka o możliwości przenoszenia się choroby z organizmu chorego lub przedmiotu z którym on się stykał na organizm zdrowy. Nie znano jednak przyczyn i fakt ten przypisywano nieokreślonym „miazmatom”, „złemu powietrzu”
Dopiero Girolamo FRACASTORO, włoski przyrodnik (XV/XVI w), wysuwa hipotezę, że musi istnieć jakiś czynnik przenoszący chorobę zakaźną. W dziele „De Contagione” pisze: „zakażenie jest podobne do gnicia, przenoszącego się z jednej rzeczy na drugą, jego zarodki (seminaria) są bardzo aktywne, są zbudowane z silnej ciągliwej substancji i odznaczają się nie tylko materialną, ale i spirytualną antypatią w stosunku do organizmu zwierzęcego”. Nie wyjaśnia jednak natury tego czynnika.
Znaczącym osiągnięciem na drodze do poznania mikroorganizmów było skonstruowanie przez braci Jensenów (XVI w), Roberta Hooke’a (XVII w) pierwszych przyrządów optycznych. Za pomocą takiego przyrządu Hook dokonuje pierwszych obserwacji komórek roślinnych. Jednak za najlepszego w tym czasie optyka i mikroskopistę uznaje się holendra A. Van Leeuwenhoek’a (z zawodu kupca, z zamiłowania przyrodnika), który skonstruował pierwowzór jednosoczewkowego mikroskopu optycznego o powiększeniu około 300x i wyższej zdolności rozdzielczej (XVII/XVIII w). Dzięki niemu po raz pierwszy zobaczył, opisał i narysował bakterie, krwinki czerwone, plemniki, szczegóły budowy tkanek. Badania te zaprzeczały idei samorództwa, jednak eksperymentalnie jej nie obaliły.
Rys.1. Mikroskop i rysunki wykonane przez Leeuwenhoek’a (9)
Dzięki odkryciom Leeuwenhoek’a K.LINEUSZ (XVIII w) uznaje odrębność niewidzialnych gołym okiem organizmów i wyodrębnia je w swoim systemie pod nazwą „Chaos infusorium”. W grupie tej umieszcza także mikroskopijne plemniki oraz „eteryczne mgiełki czasu kwitnienia”.
Pomimo tych odkryć nie wiązano jeszcze faktu obecności i funkcji życiowych mikroorganizmów z procesami biologicznymi zachodzącymi w środowisku i w otoczeniu człowieka.
Znaczącym postępem w rozwoju mikroskopii było skonstruowanie w drugiej połowie XIX w przez Abbego i Zeissa współczesnego mikroskopu optycznego z aparatem oświetleniowym (aparatem Abbego); wprowadzenie przez Siedentopfa i Zsigmondy’ego do praktyki mikrobiologicznej mikroskopu ultrafioletowego; wreszcie zbudowanie przez Ruska w latach trzydziestych XX w pierwowzoru mikroskopu elektronowego o dużej zdolności rozdzielczej. Za ojca mikrobiologii jako nauki oraz twórcę poszczególnych jej działów, a zwłaszcza mikrobiologii przemysłowej (przemysłu fermentacyjnego), lekarskiej i weterynaryjnej uznaje się francuskiego biochemika i mikrobiologa Ludwika Pasteur’a (XIX w). Najważniejsze jego osiągnięcia to:obalenie uznawanej przez Arystotelesa hipotezy samorództwa (generatio spontanea);wykazanie, że fermentacje są sposobem beztlenowego oddychanie mikroorganizmów, właściwych dla każdego typu fermentacji oraz że przyczyną chorób wina i gnicia są mikroorganizmy;opracowanie metod zwalczania pebryny jedwabników – choroby zakaźnej wywoływanej przez pierwotniaki, wprowadzenie szczepień ochronnych przeciwko wąglikowi - chorobie bakteryjnej bydła i ludzi, opracowanie metod szczepienia przeciwko cholerze drobiu oraz wściekliźnie; wykorzystanie bieżącej pary wodnej do konserwacji żywności (pasteryzacja), gorącej pary wodnej (120º) pod ciśnieniem do sterylizacji podłoży i gorącego suchego powietrza (180º) do wyjaławiania szkła; wprowadzenie metod otrzymywania czystych kultur i podłoży selektywnych.
Współtwórcą bakteriologii i pionierem współczesnej nauki o chorobach zakaźnych był niemiecki uczony Robert Koch (1843-1910), który praktykę lekarską rozpoczął jako lekarz powiatowy w Wolsztynie.
Prowadząc badania zapoczątkowane przez Pasteur’a opisuje sprawców wąglika (Bacillus anthracis), cholery (Vibrio cholerae) i gruźlicy (Mycobacterium tuberculosis). Na podstawie badań nad sprawcami chorób zakaźnych ogłasza tzw. „Postulaty Kocha”, których spełnienie jest warunkiem uznania danego mikroorganizmu za sprawcę choroby. Postulaty te obowiązują w medycynie, weterynarii i fitopatologii (nauka o chorobach roślin). Największe uznanie i Nagrodę Nobla zapewniły mu jednak badania nad gruźlicą. Ponadto Koch opracował i zastosował metody barwienia bakterii barwnikami anilinowymi, wprowadził stałe podłoża żelatynowe i agarowe, dzięki czemu usprawnił izolację mikroorganizmów i uzyskiwanie czystych kultur.
Rozwój technik badawczych pozwolił na dalsze odkrycia, między innymi w zakresie mikrobiologii rolniczej i przemysłowej. W drugiej połowie XIX w De Bary opisuje grzyby chorobotwórcze dla roślin, Hansen badający drożdże wprowadza do piwowarstwa czyste kultury, Iwanowski i Beijerinck oraz Löeffler i Frosch wykrywają istnienie czynników zakaźnych przechodzących przez przeciwbakteryjne filtry porcelanowe Chamberlanda (wirus mozaiki tytoniu oraz pryszczycy u bydła), a Wehmer opisuje wytwarzanie kwasu cytrynowego przez grzyby. W pierwszej połowie XX w Smith opisuje fitopatogenne bakterie, Weizman zajmuje się pozyskiwaniem acetonu i butanolu na drodze fermentacji beztlenowej, Tword i d’Herelle odkrywają bakteriofagi, a Winogradzki, zajmujący się krążeniem pierwiastków, rozwija mikrobiologię gleby. Wskazuje na znaczenie mikroorganizmów w utrzymaniu jej żyzności i odżywianiu roślin.
W Polsce L.Cienkowski określa przyczynę (Leuconostoc mesenteroides) i sposób zapobiegania powstawania „żabiego skrzeku” w cukrowniach, A. Prażmowski opisuje bakterie brodawkowe (Rhizobium) i symbiotyczne wiązanie azotu atmosferycznego, izoluje bakterie z rodzaju Bacillus i Clostridium, B. Niklewski opisuje bakterie wodorowe, O.Bujwid organizuje centrum pasteurowskie i pierwszą w Polsce wytwórnię surowic oraz szczepionek, T.Chrząszcz rozwija badania nad grzybami pleśniowymi, T.Matuszewski zajmuje się mikrobiologią mleczarstwa, W.Dąbrowski - przemysłem fermentacyjnym, a W.Syniewski opracowuje pierwszy polski podręcznik „Mikrobiologia fermentacyjna”. Mikrobiologię gleby rozwijają S i H.Krzemieniewscy, K.Bassalik i J.Ziemięcka.
Powrót
Poszerzenie zakresu i tematyki badań mikrobiologicznych w XX w spowodował podział mikrobiologii na szereg działów, np. mikrobiologię ogólną zajmująca się budową, funkcjami życiowymi i przemianą materii i mikrobiologię szczegółową zajmującą się poszczególnymi grupami mikroorganizmów (wirusologia, bakteriologia, czy też mikologia), a w obrębie tych działów: anatomią i morfologią, fizjologią i biochemią, ekologią, genetyką, ewolucją i systematyką. Pojawiły się też działy mikrobiologii uwzględniające miejsca bytowania mikroorganizmów (np. mikrobiologia gleby, wód i ścieków, żywności), a także ważne dla gospodarki człowieka względy praktyczne (mikrobiologia lekarska, weterynaryjna, sanitarna, rolnicza, przemysłowa i inne).
Prowadzenie tak szeroko zakrojonych badań, w dużym zakresie poza naturalnym siedliskiem bytowania mikroorganizmów, stało się możliwe dzięki wykorzystaniu w laboratoriach mikrobiologicznych:
· sprzętu pozwalającego na sterylizację pomieszczeń, szkła laboratoryjnego i podłoży, na których hodować możemy jeden, w danej chwili badany mikroorganizm (lampy bakteriobójcze, pasteryzatory, sterylizatory); bezpieczną pracę z mikroorganizmami (komory z laminarnym obiegiem powietrza) i ich hodowlę w określonych temperaturach (termostaty);
· szkła laboratoryjnego, np. płytek Petrieg’o, kolb Erlenmayer’a, w których na różnych podłożach stały się możliwe różne sposoby izolacji i hodowli mikroorganizmów;
· nowoczesnych technik mikroskopowych z wykorzystaniem mikroskopów o dużej rozdzielczości i związków chemicznych pozwalających różnicowanie mikroorganizmów lub fragmentów budowy ich komórki na drodze selektywnego barwienia. Te ostatnie pozwoliły także na sporządzanie specyficznyc...
ticlo