09.02.04
Budowa mikroskopu, rysunek... (przypomnienie z podstawówki ;)
Obraz w mikroskopie świetlnym jest obrazem rzeczywistym, powiększonym i odwróconym.
Parametry charakteryzujące obiektyw mikroskopu:
v Apertura numeryczna (A):
Ø A = N sinα, gdzie:
§ N – współczynnik załamania światła ośrodka (medium) miedzy preparatem a obiektywem
§ α – wartość kąta aperturowego, czyli kąta pomiędzy wiązką przechodząca przez oś optyczną soczewki obiektywu a graniczną wiązką wpadającą do obiektywu po przejściu przez preparat;
zależy od: szerokości soczewki obiektywu oraz jej odległości od preparatu
Ø Im większa A, tym lepiej.
v Zdolność rozdzielcza (1/D):
Ø najmniejsza odległość między dwoma punktami, które widać jako dwa osobne punkty (mówi o jakości obiektywu)
Ø D = λ / A = λ / N sinα, gdzie:
§ λ – długość fali świetlnej użytej do obserwacji
§ A – apertura numeryczna
Ø Zdolność rozdzielcza obiektywu jest tym większa (lepsza), im mniejsza jest wartość D, czyli im mniejsza λ i im większa A.
Ø Jak możemy poprawić zdolność rozdzielczą?
§ Jak największa apertura.
§ Światło o jak najkrótszej fali.
· Aby uzyskać największą zdolność rozdzielczą obiektywu, preparat oświetla się światłem UV (o najkrótszej fali, 280- 300 nm); wymaga to użycia soczewek ze szkła kwarcowego, ponieważ zwykłe szkło (krzemowe) nie przepuszcza praktycznie światła w tym zakresie widma /dlatego przez szybę nie można się opalić!/.
§ Obiektyw immersyjny – wypełnienie przestrzeni pomiędzy szkiełkiem podstawowym a obiektywem cieczą: wodą, olejkiem imersyjnym (np. cedrowym) lub wodnym roztworem glicerolu („gliceryną”); wykorzystuje się fakt, że wsp. załamania światła N jest inny w innym ośrodku
§ Fluorescencja
Oznaczenia obiektywów imersyjnych
Rodzaj imersji
Symbol
Kolor pierścienia na okularze
Woda
Biały
Olejek imersyjny, np. cedrowy
HJ
Czarny
Roztwór glicerolu w wodze, czyli tzw. „gliceryna”
Glyc
Czerwony
Wartości A i D obiektywów
A
(apertura numeryczna)
D
(odwrotność zdolności rozdzielczej)
Obiektyw suchy
≤ 0,95
- 0,3 μm
Imersja wodna
1,20
- 0,24 μm
Imersja olejkowa
1,5
- 0,19 μm
Błędy wynikające z własności obiektywu
Rodzaj błędu
Mechanizm
Sposób korekty
Aberracja sferyczna
soczewki mocno wypukłe (duża krzywizna), przy określonym N, ogniska się nie pokrywają (promienie nie ogniskują się w jednym punkcie)
tym większa, im bardziej wypukła soczewka
F1 F2
używamy kilku małych soczewek zamiast jednej dużej
Aberracja chromatyczna
Tęczowa obwódka
soczewka działa trochę jak pryzmat, rozpraszając wiązkę światła; poszczególne długości fali mają trochę inne ogniska, ogniskują się w różnych punktach
a) filtry „wycinające” część widma skupiającą się najdalej albo – jeszcze lepiej – b) komplet dwóch idealnie pasujących soczewek: dwuwypukła i płaskowklęsła.
Typy obiektywów:
o Achromatyczne (korekcja aberacji chromatycznej tylko na centralną wiązkę)
o Apochromatyczne (korekcja obu aberacji) całe pole
o Plenochromatyczne (korekcja obu aberacji) ostre
- do fotografii spod mikroskopu, gdy chcemy sfotografować większą powierzchnię
OKULAR
Okulary działają jak lupa, też mogą korygować aberracje.
Ostateczne powiększenie = powiększenie obiektywu * powiększenie okularów
najczęściej stosowane powiększenia okularu: 5, 10, 15x
Dobór odpowiedniego okularu:
Obiektyw
Okular
achromatyczny
apochromatyczny
ew. planochromatyczny
PH
Apertura*1000 powinna być podobna do ostatecznego powiększenia.
Lepiej słabszy okular i silniejszy obiektyw.
Techniki obserwacji:
Obserwacje w jasnym polu w świetle przechodzącym + zabarwienie preparatu
Obserwacja w ciemnym polu w świetle przechodzącym
(trochę jak negatyw, większy kontrast)
Światło jest skierowane przez soczewki kondensora pod pewnym kątem, tak, że do soczewek obiektywu wchodzi tylko światło ugięte lub rozproszone przez preparat.
Niezbyt dobra rozdzielczość; możliwość ujawniania w postaci białych, błyszczących plamek tych małych obiektów, które uginają znaczną część padającego światła – metoda szeroko stosowana w mikrobiologii do wykrywania bakterii.
przeżyciowo
Obserwacja w ciemnym polu w świetle odbitym
(światło nie przechodzi przez preparat, jest z boku)
Kontrast fazowy: w świetle przechodzącym; wykorzystujemy to, że różne struktury w różnym stopniu pochłaniają światło (filtry wzmacniają ten efekt); te części, które są bardziej gęste, są ciemniejsze
Szklana płytka fazowa wstawiona między preparat a oko obserwatora zwiększa kontrast. Światło padające przechodzi przez przesłonę pierścieniową, która skupia na praparacie światło w kształcie pierścienia
Min. wielkość obiektów widzialnych:
Oko nieuzbrojone: nieco powyżej 100 μm
Mikroskop świetlny: 100 nm – 1 μm
Mikroskop elektronowy: 0.1 nm (pojedyncze cząsteczki!)
W mikroskopie świetlnym możemy zobaczyć:
10-100 μm - komórki
3-10 μm - jądro komórkowe
…… μm - chloroplasty
…. μm - mitochondria
0,1- 10 μm – grubość ściany komórkowej
...
robe18