2.2 Oznaczanie aktywności poligalakturonaz metodą kolorymetryczną
Wykonanie:
- Próba właściwa (Ew): do 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 0,5 ml preparatu enzymatycznego odpowiednio rozcieńczonego 5000x i inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. reakcję enzymatyczną przerwać przez dodanie 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 – dinitrosalicylowego). Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby kontrolnej (próba ślepa nie jest wykonywana ponieważ jej absorbancja jest równoważna absorbancji próby kontrolnej).
- Próba kontrolna (Ek): 0,5 ml 0,5 % roztworu pektyny w 0,01 M buforze octanowym o pH 3,8 dodać 1 ml roztworu DNS (kwasu 3,5 – dinitrosalicylowego) i 0,5 ml preparatu enzymatycznego odpowiednio rozcieńczonego 5000x. Inkubować w czasie 10 minut w temperaturze 30°C. Następnie mieszaninę umieścić we wrzącej łaźni wodnej na okres 5 minut. Po ostudzeniu mieszaniny w strumieniu bieżącej wody, dodać 3 ml wody destylowanej, wymieszać i odczytać absorbancję na fotokolorymetrze przy 530 nm wobec próby kontrolnej.
Absorbancja A530 próby właściwej wynosi 0,195. Absorbancja A530 próby kontrolnej wynosi 0. Absorbancja A530 próby kontrolnej jest równoważna absorbancji A530 próby ślepej (dlatego próba ślepa nie jest wykonywana).
Aktywność poligalakturonazy (PG) oznacza się na podstawie ilości grup aldehydowych uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy wiązania α-1,4-glikozydowego w kwasie poligalakturonowym lub w niskozmetoksylowanej pektynie.
Aktywność poligalakturonazy wyliczam ze wzoru:
UPG= x∙R∙2212∙t μmolmin∙ml
Gdzie:
x – odczyt z krzywej wzorcowej μgpróbę
R – rozcieńczenie enzymu
t – czas reakcji enzymatycznej [min]
212 – masa 1 μmola kwasu D-galakturonowego
2 – przeliczenie na 1 ml enzymu
0,1-220 μgml
0,195-x
x= 0,195 ∙220 μgml0,1=429 μgml
Zależność 0,1 - 220 μgml wynika z krzywej wzorcowej. Krzywą wzorcową w tym przypadku nazywamy przedstawioną graficznie zależność absorbancji A530 od znanego stężenia substancji wzorcowej (kwas galakturonowy [μg/ml]). Wykonanie takiego wykresu umożliwia bezpośrednie odczytywanie szukanych stężeń na podstawie zmierzonych wartości absorbancji oznaczanych prób.
UPG= 429 μgml∙5000∙2212∙10 min μmolmin∙ml
UPG= 2023,58 μmolmin∙ml=2023,58 Jml
Aktywność enzymu określa się jako ilościowy przyrost produktów w odniesieniu do czasu reakcji katalizowanej przez ten enzym. Za jednostkę poligalakturonaz przyjmuję się taką ilość enzymu, która w ciągu 1 minuty w temperaturze 30°C uwalnia z substratu grupy redukujące w ilości równoważnej 1 μmolowi kwasu D-galakturonowego.
Uzyskana aktywność pokazuje nam, że w ciągu jednej minuty jeden ml enzymu rozłożył ok. 2024 μmoli pektyny.
jula175764