Biotransformacja – proces, w wyniku którego dochodzi do modyfikacji grup funkcyjnych związków organicznych przez żywe komórki lub izolowane z nich enzymy.
Zastosowanie:
a) do produkcji metabolitów wtórnych
b) do biotransformacji (biokonwersji) egzogennych prekursorów w bardzo wartościowe, bądź pożądane produkty
Zmienność somaklonalna – rośliny powstałe z transgenicznej komórki mogą wykazywać różne zmienione właściwości, co nazywamy zmiennością somaklonalną – dziedziczoną trwale w kolejnych pokoleniach. Zmienność somaklonalna dzieli się na dziedziczną (Spontaniczna lub indukowana) i niedziedziczną (w wyniku wpływu warunków kultury, regulatorów rozwoju…)
Kultury protoplastów –
a) stanowią unikalna populacje jednokomórkowych jednostek odizolowanych od siebie
b) każdy zastosowany czynnik eksperymentalny dociera do wszystkich komórek jednakowo, tj. w tym samym czasie i z jednakową częstotliwością c) protoplasty są bardzo przydatne w badaniach czynników indukujących organogenezę oraz w badaniach mutacyjnych.
Wykorzystanie protoplastów - Jako system jednokomórkowy, pozbawiony ścian komórkowych , zdolny do ich odtwarzania, służący do badania szeregu procesów zachodzących na poziomie:
a) biosyntezy ścian komórkowych
b) badania właściwości plazmalemmy, składu błon, ładunku, receptorów błonowych, mechanizmu aktywnego pobierania i transportu związków drobno cząsteczkowych
c) funkcjonowania organelli (łatwość ich izolacji)
d) badanie czynników wpływających stymulująco bądź hamująco na podstawowe czynniki metaboliczne
e) wpływ hormonów na morfogenezę
f) źródło pozyskania mieszańców somatycznych !!!
g) doskonały materiał do biotransformacji !!!
Pozyskiwanie protoplastów:
a) fragment tkanki, np. liści poddajemy sterylizacji oraz usuwamy epidermę
b) skrawki umieszcza się w mieszaninie enzymów macerujących ścianę komórkową (istotny w czasie inkulacji) temperatura, pH, światło i wytrząsanie
c) degradacja dwuetapowa – najpierw działają enzymy pektyno- a następnie celuolityczne
d) degradacja jednoetapowa – stosuje się mieszaninę różnych enzymów o aktywności totalnie degradującej ściany (pektyny, hemicelulozę i celulozę)
e) ważny dodatek stabilizatorów osmotycznych (o charakterze jonowym i niejonowym)
f) mieszaninę filtrujemy przez sita
g) delikatnie wirujemy
h) w zależności od zastosowanego stabilizatora frakcje protoplastów zbiera się w osadzie lub na powierzchni płynu lub ewentualnie między fazami przy zastosowanym gradiencie nieciągłym
i) przemywa kilkakrotnie roztworem stabilizatorów osmotycznych lub pożywką
j) ostatecznie protoplasty poddaje się ocenie żywotności.
Sztuczne nasiona:
a) pozbawione otoczki zarodki somatyczne poddane procedurze wysuszenia (odwodnienie)
b) otoczkowanie zarodki podczas desykacji (odwodnienie)
c) uwodnione zarodki (merystemy wierzchołkowe) otoczkowane kapsułą z żelu !!!
d) otoczkowane zarodki zanurzone w płynnym żelu.
Otoczki –
a) Otoczki alginianowe: alginiany otrzymywane są z ogromnych brązowych alg morskich Macrocytis i Laminaria drogą ekstrachowania zasadą sodową dają alginian sodu.
b) Otoczki karaginianowe: Otrzymywane z komórek czerwonych wodorostów typu Chondrus, Euchemia, Gigatrina
c) Inne otoczki: Celuloza i jej pochodne, Chitozan !!!, Żelifikujące gumy, Pektyny, Podwójne otoczkowanie (np. alginiany, pektyniany), Najnowsze otoczki hydrofobowe, Biokapsuły!!!! (osłonki zaindukowane wokół zarodka somatycznego , imitujące osłonkę nasienną z kutikulą).
Banki genów - Przechowywanie materiału roślinnego:
1) Krótkoterminowe – przechowywanie materiału roślinnego w niskiej temperaturze (ok. 40C) przy niskim natężeniu światła i na ubogich pożywkach
2) Długoterminowo:
a) W temperaturze – 700C zamrożenie przemian metabolicznych chociaż istnieje niebezpieczeństwo powolnego utlenienia tłuszczów oraz wzrost ilości mikrokryształów lodu w komórkach
b) W temperaturze -1960C (temperatura ciekłego azotu) komórki przez wiele lat nie tracą żywotności. Przechowywanie komórek in vitro w bankach genów. Proces wieloetapowy, który obejmuje etapy: wzrost wstępny, krioprotekcja (krioprezerwacja), zamrażanie, przechowywanie właściwe (-1960C), odmrażanie, przywrócenie właściwego tępa wzrostu komórką
Kalus - początkowo są to niezróżnicowane komórki parenchymatyczne o różnym kształcie i wielkości, po pewnym czasie trwania kultury kalus wykazuje heterogeniczność: obok komórek parenchymatycznych powstają nieregularne formacje tkanek przewodzących, centra merystematyczne, kalus może mieć strukturę luźną i łatwo się rozpadać lub bardzo zwartą, barwa może być zróżnicowana od białej, żółtej, pomarańczowej przez różne odcienie zieleni, analizy cytologiczne kalusa wskazują na wielką różnorodność genetyczną.
Zarodki somatyczne - mają wyraźnie zaznaczoną biegunową strukturę typu pęd-korzeń są efektem końcowym embriogenezy somatycznej. Zastosowanie: Metoda ta może znaleźć istotne zastosowanie w nasiennictwie i szkółkarstwie, ze względu na niezwykle wysoki współczynnik rozmnażania.
Bioreaktory –
Zasada funkcjonowania: Zagwarantowanie optimum warunków wzrostu i rozwoju komórką somatycznym w kierunku zainicjowania embriogenezy somatycznej poprzez regulację i kontrolę wewnętrznych czynników fizykochemicznych.
Komp. kontroli podlegają: dozowanie świeżej pożywki; kontrola ilości namnażanych komórek; temperatura (z dokładnością do 0,100C); szybkość rotacji pożywki (przemieszczanie się suspensji w bioreaktorze), zwykle 50 rpm poniżej której komórki sedymentują i zamierają; pH – sygnał uaktywniania pompy perystaltycznie włączające sterylny roztwór kwasu lu zasady (z dokładnością do 0,1 pH); poziom tleny regulowany drogą dodatkowego dotlenienia lub zmiany szybkości rotacji pożywki. Poziom tlenu między elektroda tlenową; potencjał redox; stężenie CO2 . Komórki roślinne są bardzo wrażliwe na brak tlenu – stąd konieczność ich dotleniania, jednak zbyt gwałtowne napowietrzenie (mieszanie pożywki) może również spowodować lizę komórek (stres mechanicznego urazu)
Rośliny transgeniczne: Metody wprowadzania obcych genów –
a) Mikrowstrzeliwanie
b) Odporność na wirusy
c) Odporność na owady i nicienie
d) Odporność na bakterie i grzyby.
Odporność na owady i nicienie: Źródłem do transgenezy roślin odpornych na owady i nicienie są geny z bakterii Bacillus thuringensis o charakterze endotoksyny, które w przewodzie larw owadów hamuje ich dalszy rozwój. Ta toksyna okazała się również skuteczna w odporności na nicienie. Oprócz Bt możliwe jest wprowadzenie innych genów podnoszących odporność na szkodniki m.in. warunkujących syntezę inhibitorów proteaz lub neuropeptydów.
Rośliny transgeniczne – Organizmy wyzsze, którym wprowadzono nowy, obcy gen, przekazywany następnym pokoleniom zgodnie z podstawowymi prawami dziedziczenia.
Organizmy transgeniczne – organizmy poddane transformacji tzw. posiadające zmodyfikowany genom. Powstały z takiej komórki, która włączyła do swojego genomu fragment DNA skonstruowany za pomocą inżynierii genetycznej. Fragment ten może zostać włączony prawie w każdym miejscu genomu.
Hybryda - osobnik powstały w wyniku skrzyżowania dwóch organizmów rodzicielskich należących do odrębnych taksonów (ras, odmian, podgatunków a nawet gatunków). Metody hybrydyzacji stosuje się często w produkcji roślinnej. Prócz genetycznych mieszańców (czyli krzyżówek międzygatunkowych) istnieją też mieszańce szczepieniowe (czyli wegetatywne), które powstają w wyniku połączenia tkanek osobników różnych genetycznie.
Problemy związane z mikrorozmnażaniem:
1.Mutacje (niestabilność genotypu) związane z następującymi czynnikami:
a) Wybranym rozmnażaniem in vitro
b) Rodzajem stosowanego regulatora wzrostu
c) Charakterem eksplantatu (tkanka różnicująca się lub różnicowana)
d) Rodzajem genotypu
e) Poziomem ploidalności
f) Pochodzenie eksplantatu (z tkanki jednorodnej czy chilery)
2. Indukcja organogenezy i zarodków somatycznych
3. Ukorzenianie drzew i krzewów
4.Wytwarzanie toksycznych związków, tzw. metabolitów wtórnych
5. Przenoszenie do gleby (regeneracja korzeni, adaptacja liści do prawidłowej funkcji i nieaseptycznych warunków)
6. Witryfikacje – choroba fizjologiczna (tylko w kulturach in vitro)
7. Infekcje zewnętrzne.
margo.u