135(3).pdf

Tom 58 2009

Numer 1–2 (282–283)

Strony 135–142

E wa w ójcik , E lżbiEta S malEc , k arolina G óral

Instytut Bioinżynierii i Hodowli Zwierząt

Akademia Podlaska

B. Prusa 14, 08-110 Siedlce

e-mail: wojcik@ap.siedlce.pl

esmalec@ap.siedlce.pl

mala.cz@interia.pl

ŁAMLIWE MIEJSCA CHROMOSOMU

Mutacje są źródłem zmienności genetycz-

nej i dlatego są nierozerwalnie związane ze

zmianami ewolucyjnymi, obserwowanymi

wśród organizmów żywych. Mają one cha-

rakter spontaniczny, przypadkowy i bezwa-

runkowy, i wtedy większość z nich jest nie-

korzystna dla organizmu. Mutacje mogą po-

wstawać również pod wpływem czynników

mutagennych, czyli mogą być indukowane

przez człowieka.

Jednym z rodzajów mutacji są aberracje

chromosomowe, związane z naruszeniem bu-

dowy chromosomu, wywołujące dziedziczne

zmiany cech organizmu. Do tej kategorii na-

leżą miejsca łamliwe chromosomu, widocz-

ne jako jego złamania i przerwy (D EbackEr i

k ooy 2007).

Łamliwość chromosomów prowadzi do

zmienności trudnej do przewidzenia. Może

powodować powstawanie wad rozwojowych,

wysoką śmiertelność we wczesnym okresie

życia, osłabienie żywotności zwierząt (D aniE -

lak -c zEch i S łota 2004), a także ekspansje

nowotworów (o hta i współaut. 1996).

MIEJSCA ŁAMLIWE

Termin „łamliwe miejsce” (ang. fragile

chromosome site) użył po raz pierwszy Ma-

genis w 1970 r. do opisania powtarzających

się złamań na długim ramieniu chromosomu

16 człowieka, segregujących się w mendlow-

ski sposób (patrz Durkin i G lovEr 2007). W

kolejnych latach ujawniono dodatkowe miej-

sca łamliwe, zlokalizowane w chromosomie

Xq28 (Lubs 1969, Giraud i współaut. 1976,

Harvey i współaut. 1977, Turner i współaut.

1978; patrz Durkin i G lovEr 2007). Ekspresję

miejsca łamliwego na chromosomie X powią-

zano z umysłowym upośledzeniem. Uzyskane

w przeszłości wyniki badań i odkrycia doty-

czące lokalizacji miejsc łamliwych przyczy-

niły się do ekspansji badań w tej dziedzinie

( Durkin i G lovEr 2007).

Miejsca łamliwe, to miejsca, w których

chromosomy wykazują zwiększoną częstość

złamań i przerw (b al 2006). Są klasyfiko-

wane jako rzadko występujące (S uthErlanD

i r icharDS 1999, S uthErlanD 2003) lub

pospolite (z lotorynSki i współaut. 2003,

S chwarz i współaut. 2006), w zależności od

częstości występowania w populacji. Miej-

sca łamliwe typu rzadkiego mają charakter

dziedziczny i występują w populacji incy-

dentalnie. Z kolei pospolite miejsca łamliwe

uznawane są za powszechnie występujące w

genomie danego gatunku. Ich liczba może

się wahać w szerokim zakresie (Ś witońSki

i współaut. 2006). Badania niestabilności

chromosomów wykazały, że zwiększona czę-

stość występowania miejsc łamliwych na-

stępuje w określonych i specyficznych wa-

runkach hodowli in vitro lub po indukcji

określonymi związkami chemicznymi (b al

2006).

136

E wa w ójcik i współaut.

Loci łamliwych miejsc określane są lite-

rami „FRA”, po których następuje określenie

poszczególnego chromosomu i konkretne-

go łamliwego miejsca na tym chromosomie,

oznaczonego kolejną literą. Na przykład FRA-

XA odnosi się do łamliwego miejsca A na

chromosomie X; jest to rzadkie, wrażliwe na

brak kwasu foliowego, łamliwe miejsce zwią-

zane z syndromem łamliwego chromosomu

X (n ational l ibrary o f m EDicinE ).

Regiony genomu, skłonne do niestabilno-

ści i przestawień są przypuszczalnie szkodli-

we dla organizmu i podlegają selekcji podczas

rozwoju. Fakt, że miejsca łamliwe utrzymują

się w genomie organizmów od drożdży do

człowieka sugeruje, że mają one do spełnienia

ważne funkcje w komórce (a rlt i współaut.

2006). Pełnią ważną rolę w organizacji wyż-

szej struktury chromosomu oraz w procesie

replikacji. Łamliwe miejsca są najpóźniej repli-

kowane podczas S-fazy cyklu komórkowego i

są sygnałem dla komórki o zakończeniu repli-

kacji. Czynniki kontrolujące cykl komórki mo-

nitorują te miejsca blokując wejście w mitozę

do momentu, kiedy powielanie tych fragmen-

tów nie zostanie ukończone. Wówczas rola

łamliwych miejsc w regulacji cyklu zostaje

zakończona i w większości są one destabilizo-

wane poprzez zniszczenie genów kontrolują-

cych cykl (a rlt i współaut. 2006).

Z obserwacji prowadzonych przez G E -

rickE (1999) wynika, że wzrost łamliwości

chromosomu wiąże się z zaburzeniami zacho-

wań u ludzi. Autor wyjaśnia wspólną teorię,

dotyczącą możliwego znaczenia modyfikacji

wyższej struktury DNA w koordynacji funkcji

genu w ewolucji mózgu i podczas rozwoju.

Cytogenetyczne niestabilności, przejawiają-

ce się jako łamliwe miejsca chromosomów,

miejsca wymiany chromatyd siostrzanych,

przemieszczenia, duplikacje, delecje i odwró-

cenia, prowadzą do zaburzeń zachowania

psychicznego, powstawania zmian neurode-

generacyjnych (G ErickiE 2006), a także z za-

burzeń procesów rozmnażania i reprodukcji

(D aniElak -c zEch i S łota 2004). Badania cy-

togenetycznych niestabilności na poziomie

chromatyny pozwalają na identyfikację regio-

nu regulującego procesy epigenetyczne (G E -

rickE 2006).

Łamliwe miejsca obserwowane w mikro-

skopie świetlnym jako niezabarwione dziury,

przerwy lub silne przewężenia w chromo-

somach metafazowych, sugerują anormalną

strukturę chromatyny. Identyfikacji łamli-

wych miejsc chromosomu dokonuje się na

trzech poziomach organizacji chromatyny:

— badając zdolność DNA pochodzącą od

łamliwych miejsc do kształtowania nukleoso-

mów, zasadniczych strukturalnych elemen-

tów chromosomów,

— badając układ struktury nukleosomów

powyżej łamliwych miejsc i ekspresji łamli-

wych miejsc w liniach komórek,

— wizualizując łamliwe miejsca w wyższej

strukturze chromatyny.

Łamliwe miejsca związane ze strukturą

chromatyny odgrywają aktywną rolę w pro-

cesach metabolicznych DNA takich jak: repli-

kacja, transkrypcja, naprawa i rekombinacja,

które są blisko połączone z niestabilnością

łamliwych miejsc (w anG 2006).

Przerwy nie zawsze pojawiają się przy-

padkowo. Zdarzają się w niewielu specyficz-

nych miejscach na chromosomach, kiedy

komórki są najbardziej podatne na uszkodze-

nia, podczas etapów w cyklu komórkowym,

gdy DNA jest kopiowany albo replikowany

i komórka rozdziela się na dwie identyczne

(siostrzane) komórki (a rbor 2002). Regiony

łamliwych miejsc chromosomu występujące

powszechnie i rzadko zawierają pewną ilość

genów mikroRNA (miRNA) (c alin i współ-

aut. 2004). D urkin i G lovEr (2007), mapując

małe niekodujące geny miRNA na regiony

chromosomów, zidentyfikowali łamliwe miej-

sca. Stwierdzili, że ze 186 genów miRNA, ja-

kie rozpatrywali w badaniach, więcej niż po-

łowa mapowanych genów zawierało znane

łamliwe miejsca, zarówno typu rzadkiego, jak

i występujących powszechnie.

MIEJSCA ŁAMLIWE TYPU RZADKIEGO

Rzadkie łamliwe miejsca, które są obser-

wowane w populacji w mniej niż 5%, segre-

gowane są w mendlowski sposób. Zwiększe-

nie liczby złamań w tych położeniach jest naj-

częściej spowodowane wzrostem powtórzeń

nukleotydowych (D urkin i G lovEr 2007).

Ich występowanie wiąże się zazwyczaj z na-

gromadzeniem powtórzeń 3-nukleotydowych

(często CCG). Mają one charakter dziedzicz-

ny. Dziedziczą się jak prosta mendlowska ce-

cha kodominująca (k inG i S tanSSfiElD 2002).

U człowieka klasycznym przykładem jest ze-

spół łamliwego chromosomu X, a głównym

objawem klinicznym tej choroby jest upośle-

dzenie umysłowe. Jest to najczęściej występu-

jąca postać dziedzicznego upośledzenia umy-

słowego u mężczyzn (Ryc. 1). Dziedziczenie

tej choroby sprzężone jest z chromosomem

płci X (P aSSarGE 2004).

Rzadkie łamliwe miejsca są pogrupowa-

ne zgodnie z czynnikami, które wywołują je

Łamliwe miejsca chromosomu

137

Miejsce łamliwe

Ryc. 1. Zespół łamliwe-

go chromosomu X (m E -

DicinE w orlD 2007).

podczas trwania hodowli tkankowej (D ur -

kin i G lovEr 2007). Łamliwe miejsca typu

rzadkiego ujawniają się w trakcie trwania

procesu hodowli limfocytów w medium po-

zbawionym kwasu foliowego lub z niskim

poziomem tymidyny (S uthErlanD 2003).

Główną grupą rzadkich łamliwych miejsc są

te, wrażliwe na brak kwasu foliowego (ang.

folate sensitive), połączone z rozszerzeniem

powtórzeń CGG. Grupa ta obejmuje FRAXA,

w genie FMR1 , który jest odpowiedzialny za

syndrom łamliwego chromosomu X i FRAXE

w genie FMR2 , odpowiedzialnego za opóź-

nienie umysłowe. Autosomalne „folate sen-

sitive” łamliwe miejsce w locus FRA12A, w

genie DIP2B także połączono z opóźnieniem

umysłowym. Pozostałe rzadkie łamliwe miej-

sca, obojętne na brak kwasu foliowego (ang.

nonfolate sensitive), charakteryzujące się roz-

przestrzenionymi powtórzeniami bogatymi

w pary AT, są wywoływane przez BrdU (5-

bromo-2’deoksyurydyna) albo distamycynę-A.

Zawierają one loci FRA10B i FRA16B, w któ-

rych allele z bardzo rozprzestrzenionymi po-

wtórzeniami 42- i 33-bp AT minisatelitarnymi

są wyrażane jako łamliwe miejsca (D urkin i

G lovEr 2007). Siedem z wrażliwych na brak

kwasu foliowego (FRA10A, FRA11B, FRA12A,

FRA16A, FRAXA, FRAXE i FRAXF) i dwa z

obojętnych na brak kwasu foliowego (FRA-

10B i FRA16B) loci łamliwych miejsc, zostały

scharakteryzowane pod względem molekular-

nym (l ukuSa i f rynS 2008). Opóźniona repli-

kacja jest charakterystyczną cechą rzadkich

łamliwych miejsc. Po raz pierwszy pokazana

została w łamliwym chromosomie X umiej-

scowionym w genie FMRl , a później w loci

FRAXE, FRA16B, i FRA10B. Prawdopodob-

nym wyjaśnieniem opóźnionej replikacji w

rzadkich łamliwych miejscach jest ekspansja

znalezionych w tych miejscach powtórzeń

CGG i AT, mogących tworzyć drugorzędowe

struktury, takie jak spinki, które blokują po-

stęp na widełkach replikacyjnych (D urkin i

G lovEr 2007).

MIEJSCA ŁAMLIWE TYPU POSPOLITEGO

Pospolite łamliwe miejsca (CFSs), które

są obserwowane u wszystkich gatunków ssa-

ków: kotów, psów, świń, koni, krów, jeleni,

szczurów, czy myszy stanowią największą

klasę łamliwych miejsc (G lowEr i współaut.

2005). W odróżnieniu do rzadkich łamliwych

miejsc, CFSs reprezentują składnik normal-

nej struktury chromosomu i nie są wynikiem

powtórzeń nukleotydowych (D urkin i G lo -

vEr 2007). Uznawane są one za powszechnie

występujące w genomie danego gatunku, ale

ich liczba może się wahać w szerokim zakre-

sie. Ujawnienie się miejsc łamliwych pospoli-

tych może być skorelowane z kancerogenezą

(Ś witońSki i współaut. 2006).

Miejsca łamliwe występujące powszech-

nie są zazwyczaj stabilne w komórkach soma-

tycznych. Gdy poddaje się je działaniu inhibi-

torów replikacji w warunkach hodowlanych,

łamliwe miejsca przejawiają rożne cechy nie-

stabilności DNA, takie jak: przerwy, złamania,

przegrupowania (G lovEr 2006). Afidioko-

lina (inhibitor polimerazy DNA — APH) lub

bromodeoksyurydyna, a także 5-azacytydyna

(5-AZA) indukują miejsca łamliwe pospolite

(Ś witońSki i współaut. 2006). Inne inhibitory

indukcji, np. hydroksymocznik, są mniej spe-

138

E wa w ójcik i współaut.

cyficzne w indukowaniu defektów, zwłaszcza

w łamliwych miejscach, prawdopodobnie z

powodu różnic w mechanizmach hamowania

replikacji (a rlt i współaut. 2003, 2006).

Pospolite miejsca łamliwe, to duże re-

giony niestabilności genomu, które można

znaleźć u wszystkich organizmów. Są one

gorącymi miejscami, gdzie następuje reorga-

nizacja chromosomu i często dochodzi do

delecji. Pewna liczba tych łamliwych miejsc

została znaleziona i obejmuje geny, które są

kodowane przez bardzo duże regiony geno-

mu (S mith i współaut. 2007). Model miejsc

CFSs oparty jest na bazie opóźnionej albo

wstrzymywanej replikacji, roli w strukturze

sekwencji białek, które kontrolują przebieg

transkrypcji w stabilności łamliwych miejsc.

Sekwencja w łamliwych miejscach stwarza

trudności w replikacji, dalej jest wstrzymy-

wana przez afidiokolinę i pewne inne formy

obciążające replikację. Niezupełna replikacja

w tych miejscach może prowadzić do chro-

mosomowych przerw i złamań albo „ekspre-

sji” łamliwych miejsc (a rlt i współaut. 2006,

G lovEr 2006, P ichiorri i współaut. 2008).

Le Beau i współaut. (1984) obserwowali

spóźnioną replikację łamliwych miejsc CFSs

i jako pierwsi pokazali, że sekwencja w FRA-

3B powielana jest bardzo późno i jest do-

datkowym wynikiem działania APH, a w re-

zultacie znacząco opóźnionej replikacji, bo

w około 16,5% locus FRA3B w stosunku do

pozostałych niereplikowanych fragmentów

w fazie G2 (patrz D urkin i G lovEr 2007).

Badania nad regulacją replikacji w CFSs,

FRA16D i FRA7H, wskazują, że loci te mogą

także mieć trudności w postępie widełek

replikacyjnych. Autorzy opracowali model,

w którym regiony CFS inicjują replikację

poprawnie, ale są powolne w ukończeniu

tego procesu, dlatego w sąsiedztwie miejsc

niereplikowanego DNA dochodzi do łama-

nia się chromosomu. Ta spóźniona replika-

cja w CFSs może, podobnie jak w rzadkich

łamliwych miejscach, wynikać z formowania

drugorzędowych struktur, które opóźniają

postęp widełek replikacyjnych, albo może

wynikać z innych czynników, które wpływa-

ją na dynamikę replikacji w tych regionach

(D urkin i G lovEr 2007).

W ostatnich latach znacznie wzrosła wie-

dza o genomowej strukturze CFSs i komór-

kowych mechanizmach kontrolujących ich

stabilność. Badania CFSs pozwoliły na powią-

zanie czynników transkrypcyjnych komórki

i naprawy DNA, z wielorakimi białkami tego

cyklu, które uczestniczą w stabilności CFS

(D urkin i G lovEr 2007, P ichiorri i współ-

aut. 2008), np:

— ATR — ataksja-telangiektazja i związana

z Rad3, kinaza (a rlt i współaut. 2003);

— BRCA1 — ludzki gen supresorowy znaj-

dujący się na długim ramieniu 17 chromo-

somu w locus 17q21 (m iki 1994), ekspresja

zmutowanego BRCA1 osłabia kontrolę w

punkcie kontrolnym fazy G2/M (l arSon i

współaut. 1997);

— CHK1 — (ang. checkpoint kinaze), ho-

molog kinazy cyklu komórkowego u drożdży

(a rlt i współaut. 2003);

— RAD51 — homolog prokariotycznego

genu RecA e. coli , który jest ulokowany na

długim ramieniu (q) na chromosomie 15

(a rlt i współaut. 2006), mutacje w tym ge-

nie prowadzą do zwiększenia liczby podwój-

nych złamań (S hinohara i współaut. 1992).

W 2002 r. Glover i współautorzy z Medi-

cal School i Howard Hughes Medical Institu-

te odkryli (patrz a rbor 2002), że białko ATR

chroni łamliwe miejsca od złamania podczas

replikacji DNA. ATR reguluje sygnały działa-

nia kilku ważnych białek w łańcuchu, które

kontrolują replikację w komórce. Kiedy re-

plikacja przeciąga się, ATR wysyła chemicz-

ny sygnał „mówiący” komórce o zatrzymaniu

replikacji do momentu, gdy zostanie ziden-

tyfikowany problem. Ponadto a rbor (2002)

cytując pracę Casper (2002) podaje, że duży

poziom afidiokoliny w komórce bez ATR w

warunkach hodowlanych powoduje większą

liczbę złamań. Złamania w łamliwych miej-

scach były od 5. do10. razy liczniejsze w po-

równaniu do normalnych komórek. Nieule-

gające replikacji regiony mogą stymulować

w fazie S i/albo G2/M aktywację czynników

transkrypcyjnych, w których ATR gra klu-

czową rolę. Jednak identyfikacja łamliwych

miejsc na metafazowych chromosomach su-

geruje, że duża liczba tych defektów może

umknąć kontroli czynników transkrypcyj-

nych. Delecje albo translokacje w łamliwych

miejscach mogą wynikać z podwójnych zła-

mań nici DNA, spowodowanych uszkodze-

niami już osłabionego regionu na pojedyn-

czej nici albo anormalnego procesu łączenia

przerw przy uszkodzonych widełkach (G lo -

vEr 2006).

Ekspresja cytogenetyczna CFS ujawnia

się w określonych warunkach stresu replika-

cyjnego. CFSs służą jako ,,podpisy” w stresie

replikacyjnym co w konsekwencji pozwala

zrozumieć mechanizm niestabilności geno-

mu w normalnej i nowotworowej komórce

(D urkin i G lovEr 2007).

Łamliwe miejsca chromosomu

139

ŁAMLIWOŚĆ CHROMOSOMÓW A KANCEROGENEZA

Niestabilność genetyczna, chromosomo-

wa i mikrosatelitarna jest jedną z charakte-

rystycznych cech komórek nowotworowych.

W komórkach nowotworowych niestabilność

chromosomowa wyraża się nagromadzeniem

aberracji strukturalnych i liczbowych chro-

mosomów (S ąSiaDEk i współaut. 2003). Do-

niesienia naukowców przedstawiają coraz

więcej dowodów na to, że istnieje związek

pomiędzy miejscami łamliwymi i chorobą

nowotworową. Badacze znajdują złamania

i przerwy w chromosomach w komórkach

rakowych (S EPPa 1998). Łamliwe miejsca i

związane z nimi geny są często tracone lub

przegrupowywane w wielu komórkach no-

wotworowych (G lovEr 2006). Obserwowa-

ne delecje w komórkach rakowych biorą

się z nieodpowiednich albo wadliwych ho-

mologicznych napraw blokowanych widełek

i mogą być wzmacniane przez mutacje w

punkcie kontrolnym replikacji.

Odkrycie różnych typów naturalnych

łamliwych miejsc w chromosomach drożdży

i charakterystyka związanych z nimi delecji,

duplikacji i translokacji, ujawnia potencjalne

mechanizmy łamliwości i wynikającej z niej

reorganizacji chromosomu. Zrozumienie me-

chanizmu zapewni wgląd w powstawanie no-

wotworu. Delecje oraz reorganizacja w łamli-

wych miejscach typu CFSs i powiązane geny

supresorowe są pierwotnymi efektami w

genezie nowotworów (f rEuDEnrEich 2007).

D urkin i G lovEr (2007) w komórkach hodo-

wanych in vitro stwierdzili, że CFSs są gorą-

cymi miejscami dla przerw i złamań w chro-

mosomach metafazowych i powodują reorga-

nizację chromosomu. Bazując na tej charakte-

rystyce oraz związku CFSs i punktów złamań

w zespolonych chromosomach, pewna ilość

wcześniejszych prac sugeruje, że CFSs mogą

być odpowiedzialne za niektóre reorganiza-

cje chromosomów zaobserwowane w nowo-

tworach. Jednakże ich prawdziwe biologicz-

ne znaczenie i udział w reorganizacji chro-

mosomu w nowotworach komórki nie były

jasne, dopóki nie sklonowano pewnej ilości

CFSs. Chociaż CFSs nie są zaangażowane w

często powtarzającą się translokację w raku

i białaczce, liczne badania pokazały, że CFSs

są miejscami częstych delecji i innych chro-

mosomowych reorganizacji w komórkach

guzów.

W przeciwieństwie do normalnych ko-

mórek, badania wskazują, że łamliwe miej-

sca są identyfikowane z częstymi złamaniami

i przestawieniami w komórkach rakowych

(m atSuyama i współaut. 2004). Większość

badań skupiało się na sekwencjach FRA3B/

FHIT (ang. fragile histidine triad) i FRA16D/

WWOX (ang. WW domain-containing oxido-

reductase), ponieważ są one dwoma najczę-

ściej ulegającymi ekspresji i najbardziej cha-

rakterystycznymi łamliwymi miejscami i oby-

dwa leżą w obrębie licznych genów supreso-

rowych (m atSuyama i współaut. 2004, a rlt

i współaut. 2006, k uroki i współaut. 2006,

P ichiorri i współaut. 2008). FRA3B często

wykazuje utratę alleli albo homozygotyczne

delecje w wielu typach nowotworów, np.

zlokalizowanych w płucach, przewodzie po-

karmowyn, nerce czy klatce piersiowej (a rlt

i współaut. 2006).

ATR reguluje sygnały działania kilku róż-

nych ważnych białek, kontrolujących repli-

kację w komórce (a rbor 2002). Komórki

z białkiem BRCA1 mają dużą liczbę miejsc

wykazujących niestabilności chromosomo-

we (v Enkitaraman 2002). Mutacje w genie

BRCA1 powiększają m.in. ryzyko raka piersi

(n aroD i współaut. 2000).

Łamliwe miejsca, defekty w replikacji

DNA lub dysfunkcja telomeru mogą pobu-

dzać amplifikację genów w nowotworach

(a lbErtSon 2006). Sekwencje telomerów

mogą wpływać na aberracje chromosomowe

(b oufflEr 1998). Dowiedziono, iż struktura

telomeru ma znaczenie w regulowaniu sta-

bilności genomu, starzeniu się komórki i po-

wstawaniu nowotworów (D Elany i współaut.

2003). Identyfikacja łamliwych miejsc jest

drogą do wyjaśnienia mechanizmu kancero-

genezy, ponieważ łamliwość w określonych

miejscach chromosomu może być przyczyną

tworzenia się nowotworu (t ai i współaut.

1998, S chwarz i współaut. 2006).

ZACHOWANIE W EWOLUCJI

Znajdowane łamliwe miejsca u ludzi, na-

czelnych, myszy, a nawet drożdży skłoniło

Glovera (2002) (patrz a rbor 2002) do zada-

nia retorycznego pytania: „Skoro są to okoli-

ce DNA skłonne do złamań i trudne do re-

plikacji, to dlaczego zachowywały się one

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: