Enzymologia.docx

Enzymologia

Wykład 1

4.10.2010

Enzymologia – nauka zajmująca się badaniem struktury i możliwości stosowania białek katalitycznych – enzymów.

Zakres klasycznych zagadnień, które obejmuje enzymologia:

·         Wyodrębnianie enzymów z materiału biologicznego i ich oczyszczanie do stanu homogennego.

·         Badanie składu chemicznego i struktury molekularnej enzymów.

·         Wyjaśnianie katalitycznego mechanizmu działania enzymów i ustalanie reakcji miedzy struktura a katalityczna funkcją.

·         Badania kinetycznych i termodynamicznych właściwości enzymów.

·         Badanie biosyntezy enzymów i mechanizmów jej regulacji.

·         Ustalanie lokalizacji enzymów w komórce, a w przypadku enzymów pozakomórkowych badanie mechanizmów ich sekrecji

·         Ewolucja enzymów: katalizowanie się funkcji enzymów w procesie ewolucji, określanie stopnie homologii enzymów, ewolucyjne rodziny enzymów.

Nowe  tendencje w enzymologii:

·         Poszukiwanie nowych aktywnych enzymów, zwłaszcza u organizmów z ekstremalnych biotopów.

·         Ulepszanie natywnych enzymów, ukierunkowana ewolucja enzymów In vitro.

99% enzymów to enzymy mikrobiologiczne pochodzące od drobnoustrojów, stąd większa pula genów powinna być niedostępna dla biotechnologii -  stąd nowe metody w enzymologii.

Ulepszanie enzymów

Metoda dająca szybkie efekty to ukierunkowana ewolucja enzymów In vitro. Cięcie genów i łączenie ich przypadkowo oraz metoda amplifikacji – powielania DNA wyjściowego; polimerazy wprowadzają błędy co uniemożliwia utworzenie różnych wariantów genów, a w konsekwencji większe prawdopodobieństwo uzyskania wariantu o lepszej cesze. Szybka selekcja klonów – technika wysokoprzepustowego screeningu.

Inny grupy biokatalizatorów:

·         Rybozomy (RNA),

·         Enzymy (białka katalityczne)

·         DNA-zymy - Fragmenty cząsteczki DNA (metabolizm kwasów) (In vitro) - katalizują reakcje związane z syntezą kwasów nukleinowych.

·         Mikrozymy - Białka enzymatyczne mają masy cząsteczkowe od 10 do kilku milionów Daltonów, w ostatnim przypadku chodzi o enzymy oligomeryczne. W mikroorganizmach występują mikrozymy w zasadzie peptydy katalityczne. Ich badanie nie jest łatwe, ponieważ trudno jest je wyizolować z materiału genetycznego. Najmniejszym opisanym mikrozymem jest lipaza zbudowana z 17 aminokwasów. Hydrolizuje triacyloglicerole.

·         Katalityczne przeciwciała – białka o specyficznej strukturze charakterystycznej dla przeciwciał. Niektóre z nich wykazują aktywność. Niektóre przeciw In vitro katalizują reakcje ale i w warunkach In vivo. Przykładem przeciwciała o właściwości allilolitycznej są przeciwciała w mleku matki.

W biotechnologiach: przemysłowej (biała), medycznej (czerwona), agrotechnologii (zielona), ochronie środowiska (fioletowa), enzymy są podstawą. Wykorzystuje się w biotechnologii całe komórki, mieszaniny enzymów lub ich części.

Obniżanie kosztów uzyskuje się przez:

·         Stosowanie enzymów niehomogenicznych,

·         Stosowanie mas biotechnologicznych,

·         Stosowanie enzymów im mobilizowanych – enzym można wykorzystać wielokrotnie.

Wykład 2

11.10.2010

Enzym – chiralny „rozpuszczalnik” określonego substratu (ów), zapewniający środowisko reakcji odpowiednie dla optymalnego efektu katalitycznego. Efekt ten wynika z chiralności wszystkich enzymów.

1.       Są to białka o masie z zakresu 9-155 kDa, jeśli są zbudowane z pojedynczego łańcucha polipeptydowego i do 6x 106 Da w przypadku enzymów oligomerycznych. Enzym monomeryczny nie musi składać się z jednego łańcucha polipeptydowego. Ale też są i takie enzymy monomeryczne które składają się z większej ilości łańcuchów (np. chymotrypsyna 3 łańcuchy), połączonych mostkami disiarczkowymi.

2.       Charakteryzują się strukturalną czułością , specyficznością, tj. decydują o kierunku przemiany substratu (-ów) o określonej strukturze. Ich specyficzność jest wyższa niż innych katalizatorów. Mają zdolność rozpoznawania substratów i wiązania tylko tych, które są strukturalnie dopasowane do centrum aktywnego danego enzymu. Działają specyficznie: nadają kierunek reakcji np. czy będzie utlenianie, jest to specyficzność  kierunkowa, oraz decydują jaki substrat oraz substraty ulęgną reakcji. Jest to specyficzność substratowa.

3.       Przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi reakcji o co najmniej 106 raza, dzięki znacznemu obniżeniu swobodnej energii aktywacji. Jest to efektem zmiany molekularnego mechanizmu reakcji niekatalizowanej (spontanicznej). Reakcje niekatalizowane przez enzymy charakteryzują się o wiele wyższa bariera energetyczna niż reakcji katalizowane przez enzymy. Enzymy nie zmieniają stałej wartości szybkości reakcji, przyśpieszają osiągniecie stanu równowagi.

Przykłady:

2H2O2katalaza2H2O+O2

Stała katalityczna (liczba obrotów enzymu) – Liczba cząsteczek substratu przemieniona w ciągu jednej sekundy przez jedna cząsteczkę enzymu.
Np. katalaza – 1 cząsteczka enzymu przekształca 10 milionów cząsteczek nadtlenku wodoru w ciągu jednej sekundy.

Dlaczego enzymy działają specyficznie?

·         Cechą, która najbardziej odróżnia enzymy od innych katalizatorów jest ich zdolność takiego wiązania substratów, aby ich atomy były maksymalnie zbliżone do siebie, a także maksymalnie zbliżone do odpowiednich katalitycznych reszt aminokwasów centrum aktywnego. Odległości między atomami w takim układzie wynoszą tyle co długość wiązania kowalencyjnego, co skutkuje zwiększeniem reaktywności substratu po połączeniu z enzymem.

·         Ważna jest odpowiednia budowa CA, które jest przystosowane do określonego substratu, tak aby odpowiednie atomy substratu i katalityczne reszty aminokwasów enzymu były zbliżone. Substrat jest unieruchomiony w połączeniu z enzymem, co ogranicza jego ruchy rotacyjne.

W procesie katalizy enzymatycznej decydujące znaczenie mają:

1)      Odpowiedni układ grup chemicznych łańcuchów bocznych aminokwasów, zdolny do zdeformowania i polaryzacji wiązań cząsteczki substratu, tak, aby uczynić ją bardziej reaktywną.

2)      Odpowiednia budowa centrum wiążącego, które unieruchamia cząsteczkę substratu w położeniu odpowiadającym ułożeniu grup reaktywnych w centrum aktywnym enzymu.

E+Setap fizyczny (1)ESetap cheniczny (2)EPetap fizyczny (3)E+P

(1)    Etap fizyczny to związanie cząsteczki substratu w CA, jest wynikiem zderzenia cząsteczki enzymu z cząsteczką substratu. Nie wszystkie zderzenia są skuteczne (efektywne) ze względu na energię kinetyczną substratu i enzymu, a także In vivo w tym środowisku w komórce znajduje się wiele rozmaitych związków które mogą się z enzymem zderzać.

Etap ten jest charakteryzowany przez stałą Michaelissa, a jej odwrotność to powinowactwo enzymu do substratu czyli wiązalność danego substratu przez enzym.

Dopiero wówczas kiedy w centrum aktywnym ulokuje się i zwiąże się substrat specyficzny względem danego enzymu, może nastąpić etap chemiczny.

(2)    Etap chemiczny jest poprzedzony zmianami konformacyjnymi enzymu zachodzącymi w trakcie wiązania substratu. Jest to układ dynamiczny. Jeżeli do Centrum Aktywnego dostanie się substrat specyficzny dla danego enzymu wówczas zmienia się usytuowanie pewnych grup funkcyjnych cząsteczki enzymu, zmienia się konformacja enzymu na bardziej ścisłą. Centrum Aktywne jest zlokalizowane w kieszeni katalitycznej we wgłębieniu białka globularnego jakim jest enzym. Etap wiąże się z konformacyjnym stresem co przejawia się uporządkowaniem układu, czyli gwałtownym spadkiem entropii układu, dzięki czemu może nastąpić przekształceniu cząsteczki substratu w produkt. Skutkuje to osiągnięciem stanu przejścia (tranzycji) i w tym stanie następuje przekształcenie substratu w produkt reakcji. Reakcja w tym stanie przebiega spontanicznie, szybko.

(3)    Ostatnim etapem jest oddzielenie cząsteczki enzymu z kompleksu enzym-produkt, a enzym wraca do konformacyjnego stanu sprzed reakcji. 

Całość reakcji jest charakteryzowana przez iloczyn odwrotności stałej Michaellisa i stałej katalitycznej i jest to stała wydajności katalitycznej, często określana jako stała specyficzności reakcji danego enzymu.

Keff=kkatKm 1s∙dm3mol

Dla enzymów które są dobrze zoptymalizowane jeśli chodzi o ich strukturę ta stałą efektywności jest rzędu 1015-17 Uważa się takie enzymy za prawie idealne do katalizowanie danej reakcji.

Centrum Aktywne:

Zbudowane jest z  Obszaru wiążącego i obszaru katalitycznego. Są one oddzielone od siebie. Substrat wiązany jest wiązaniami elektrostatycznymi lub kowalencyjnymi w Centrum aktywnym. Drugim obszarem jest obszar katalityczny. W tych dwóch obszarach można wyróżnić dwa rodzaje aminokwasów: kontaktowe (znajdują się najbliżej, w odległości równej długości wiązania kowalencyjnego od atomów substratu, odpowiadają za specyficzność działania. Poza obszarem również są aminokwasy stabilizujące. Wymiana tych aminokwasów wpływa na działanie enzymów. Aminokwasy pomocnicze, nie wiadomo jaką funkcje spełniają w katalizie. Jeżeli się otrzyma muteinę (zmutowane białka), wymiana aminokwasów pomocniczych skutkuje obniżenie aktywności enzymu.

Przykłady aminokwasów katalitycznych.