6. PODSTAWY CYTOCHEMII I HISTOCHEMII
Histochemia jest to zbiór metod pozwalających na umiejscowienie w komórkach (cytochemia) i tkankach (histochemia) określonych substancji chemicznych oraz enzymów. Stanowi połączenie metodyki histologicznej i reakcji chemicznych. W odróżnieniu od barwienia histologicznego, mającego na celu skontrastowanie struktur komórkowych i tkankowych, reakcje histochemiczne prowadzą do uwidocznienia w preparacie mikroskopowym jedynie ściśle określonych substancji lub grup chemicznych, będących przedmiotem badań. Reakcje te cechuje zatem specyficzność (swoistość), stanowiąca podstawową własność metodyki histochemicznej.
6.1. Reakcje histochemiczne
6.1.1. Podstawy reakcji histochemicznych
W reakcji histochemicznej dochodzi do oddziaływania pomiędzy wykrywaną substancją, obecną w materiale biologicznym, a wprowadzonymi do środowiska reakcji związkami chemicznymi (substratami). Prowadzi to do powstania w miejscach występowania wykrywanej substancji produktu reakcji histochemicznej, którego lokalizacja i ilość jest następnie oceniana w obrazie mikroskopowym. Produkt ten musi spełniać dwa podstawowe warunki:
· musi być widoczny w obrazie mikroskopowym (tzn. barwny, fluoryzujący lub elektronowo gęsty);
· powinien być nierozpuszczalny w środowisku reakcji (prawie zawsze jest to środowisko wodne), aby nie dopuścić do jego dyfuzji z miejsca powstania do otoczenia i w konsekwencji do zatarcia pierwotnej lokalizacji.
Do końcowej oceny reakcji histochemicznych można użyć - w zależności od zastosowanej metodyki - wszystkich typów mikroskopów świetlnych i elektronowych.
6.1.2. Typy reakcji histochemicznych
Wykrywanie określonych substancji lub grup chemicznych w komórkach i tkankach opiera się na kilku zasadniczych typach reakcji histochemicznych:
· bezpośrednia reakcja wykrywanej substancji lub grupy z substratem, prowadząca do powstania produktu wyznaczającego miejsce jej lokalizacji (np. reakcja z dwunitrobenzenem wykrywająca reszty tyrozynowe białek);
· reakcja dwu- lub kilkuetapowa, w której wstępnie dochodzi do zmiany struktury chemicznej wykrywanej substancji, a następnie ten zmieniony związek chemiczny wykrywany jest przez przeprowadzenie końcowej reakcji barwnej (np. tworzenie grup aldehydowych w wielocukrach pod wpływem utlenienia i ich następowe uwidocznienie odczynnikiem Schiffa w reakcji P.A.S.);
· specyficzne wiązanie niektórych barwników na drodze oddziaływań elektrostatycznych (np. wykrywanie kwaśnych, anionowych glikozoaminoglikanów kationowym błękitem alcjanowym);
· stereospecyficzne wiązanie niektórych barwników przez określone związki wysokocząsteczkowe (np. wykrywanie DNA zielenią metylową);
· wybiórcze uwidacznianie niektórych związków chemicznych oparte na selektywnej rozpuszczalności w nich barwników (np. wykrywanie lipidów Sudanem III).
Niekiedy złożone procedury histochemiczne mogą być kombinacją kilku powyższych typów reakcji. Odrębnym działem histochemii są reakcje enzymatyczne (p. dalej).
6.2. Przygotowanie materiału do badań histochemicznych
Wybór metodyki przygotowania materiału biologicznego do reakcji histochemicznej podporządkowany jest charakterowi wykrywanej substancji oraz wymaganiom i specyficzności reakcji. Niekiedy nawet dobre zachowanie struktury materiału musi zejść na drugi plan wobec konieczności stworzenia warunków umożliwiających optymalne i swoiste uwidocznienie wykrywanych związków chemicznych.
6.2.1. Utrwalanie
Wybór utrwalacza powinien uwzględniać jak najpełniejsze zachowanie badanej substancji w materiale, i to w niezmienionej chemicznie postaci. Przy wykrywaniu enzymów musi zostać zachowana aktywność badanego enzymu. Niekiedy jest to możliwe jedynie w materiale nie utrwalonym - wówczas utrwalanie przeprowadza się po reakcji histochemicznej.
Rodzaj utrwalacza i czas utrwalania jest zazwyczaj zalecany indywidualnie dla każdej reakcji histochemicznej i podany w przepisie metody. Ujmując rzecz ogólnie, najczęściej stosowanymi w histochemii utrwalaczami prostymi są:
· dla białek: formaldehyd,
· dla cukrowców: alkohol absolutny, sole ołowiu,
· dla lipidów: czterotlenek osmu, kwas chromowy,
· dla kwasów nukleinowych: alkohol, kwas octowy,
· dla amin biogennych: formaldehyd,
· dla enzymów: formaldehyd, aceton.
Dla niektórych substancji zalecane są również utrwalacze złożone, np. kwas pikrynowy/etanol/formaldehyd/kwas octowy dla glikogenu, podoctan ołowiu/etanol/kwas octowy dla glikozoaminoglikanów, czy utrwalacz Carnoya dla kwasów nukleinowych.
6.2.2. Przygotowanie materiału do badań w mikroskopie świetlnym
Zatapianie w parafinie materiału przeznaczonego do badań histochemicznych może być stosowane przede wszystkim w przypadku wykrywania białek, kwasów nukleinowych i cukrowców, gdyż powoduje wypłukanie i utratę lipidów oraz inaktywację prawie wszystkich enzymów.
Przy wykrywaniu amin biogennych metodą z wyboru jest liofilizacja tkanki i utrwalenie w parach formaldehydu. Liofilizacja jest również chętnie stosowana przy wykrywaniu glikogenu i innych cukrowców. Materiał liofilizowany zatapia się w parafinie.
W badaniach histochemicznych bardzo często korzysta się z techniki mrożeniowej (skrawki kriostatowe), która w razie potrzeby pozwala na uzyskanie skrawków z materiału nie utrwalonego, a ponadto zachowuje w skrawanej tkance wszystkie zawarte w niej wysokocząsteczkowe substancje chemiczne i nie inaktywuje enzymów.
6.2.3. Przygotowanie materiału do badań w transmisyjnym mikroskopie elektronowym
Z reguły reakcję histochemiczną przeprowadza się po utrwaleniu materiału biologicznego, a przed jego zatopieniem w żywicy i pokrojeniem na ultracienkie skrawki. Z uwagi na ograniczone możliwości dyfuzji wysokocząsteczkowych odczynników histochemicznych w głąb materiału, przed reakcją kroi się go na "plasterki" grubości ok. 50‑100 mm przy pomocy specjalnych mikrotomów przystosowanych do skrawania miękkich, niezatopionych tkanek (tzw. siekacz, ang. tissue chopper, lub mikrotom wibracyjny, ang. vibratome). Przy braku takich możliwości można przeprowadzać reakcję na bardzo małych fragmentach materiału (<1 mm), ale wówczas do analizy mikroskopowej nadawać się będą jedynie skrawki z jego powierzchniowej strefy, gdzie z uwagi na najlepszą dyfuzję substratów nagromadzi się najwięcej produktu reakcji (ryc. 6.1).
Po przeprowadzeniu reakcji histochemicznej i wypłukaniu, materiał rutynowo odwadnia się, zatapia i kroi na ultracienkie skrawki. Kontrastowanie skrawków jest niekiedy niewskazane z uwagi na możliwość zamaskowania lokalizacji produktu reakcji.
Niektóre reakcje histochemiczne można przeprowadzać bezpośrednio na skrawkach ultracienkich, zwłaszcza jeżeli materiał został zatopiony w polarnej żywicy. W przypadku żywic niepolarnych (epon) zakres możliwych do wykonania reakcji jest bardzo organiczony, a dodatkowo konieczne jest zazwyczaj wstępne "zmiękczenie" żywicy przy pomocy roztworów utleniających.
6.3. Wykrywanie białek
Większość histochemicznych metod wykrywania białek opiera się na reakcjach barwnych z resztami określonych aminokwasów. Należą tu m.in.:
· reakcja Millona z kwasem azotowym, azotanem rtęci i azotanem sodu (wykrywa reszty tyrozyny),
· reakcja z dwunitrofluorobenzenem (wykrywa reszty tyrozyny, -SH i -NH2,
· reakcja z naftolo-etylenodwuaminą (wykrywa reszty tryptofanu),
· reakcja z dwuchloronaftolem (wykrywa reszty argininy),
· reakcja z błękitem rtęciowo-bromofenolowym (wykrywa większość białek).
Wymienione powyżej klasyczne metody histochemicznego wykrywania białek są obecnie rzadko wykorzystywane z uwagi na możliwość stosowania bardziej swoistych metod immunohistochemicznych (p. rozdz. 7).
6.4. Wykrywanie cukrowców
6.4.1. Reakcja P.A.S
Jest to jedna z najpopularniejszych i najszerzej stosowanych reakcji histochemicznych. Wykrywa obojętne wielocukrowce zawierające pierścienie heksozowe. W pierwszym etapie reakcji materiał poddaje się utlenieniu w 1% kwasie nadjodowym, które prowadzi do przekształcenia grup glikolowych (zwłaszcza w pozycji 1,2) w grupy aldehydowe. W drugim etapie grupy te uwidacznia się przy użyciu odczynnika Schiffa, czyli odbarwionej formy fuksyny zasadowej (ryc. 6.2).
P.A.S.-dodatnie są wszystkie struktury komórkowe i tkankowe wykazujące obecność większych ilości wielocukrowców (glikokaliks brzeżków szczoteczkowych, błony podstawne, wewnątrzkomórkowe złogi glikogenu, glikoproteidowe i śluzowe ziarna wydzielnicze). Niektóre lipidy mogą również reagować P.A.S.-dodatnio, gdyż utlenianie kwasem nadjodowym powoduje powstanie w ich cząsteczkach grup aldehydowych. Dotyczy to przede wszystkim nienasyconych fosfolipidów, takich jak sfingomielina, kardiolipina i ceroid.
6.4.2. Wykrywanie kwaśnych glikozoaminoglikanów błękitem alcjanowym
Błękit alcjanowy jest barwnikiem kationowym, natomiast kwaśne glikozoaminoglikany są polianionami. Dochodzi zatem do elektrostatycznego wiązania barwnika z glikozoaminoglikanami, przy czym swoistość barwienia zależy od pH błękitu alcjanowego (co wiąże się ze stopniem jego jonizacji): w pH poniżej 1,0 barwią się wyłącznie silnie kwaśne glikozoaminoglikany zawierające znaczną liczbę reszt siarczanowych, w pH 2,5 kwas hialuronowy, sialomucyny i glikozoaminoglikany o niewielkiej kwasowości, a powyżej pH 5,5 swoistość barwienia znacznie spada.
6.4.3. Wykrywanie kwaśnych glikozoaminoglikanów żelazem koloidalnym
Metoda ta opiera się na powinowactwie jonów Fe3+, tworzących koloidalne agregaty, do kwasowych reszt glikozoaminoglikanów w pH 2,0. W pierwszym etapie reakcji zachodzi wiązanie żelaza koloidalnego z glikozoaminoglikanami, w drugim zaś działając żelazocyjankiem potasu i kwasem solnym przekształca się żelazo związane z tkanką w barwny błękit pruski, [Fe(CN6)]3Fe4.
6.4.4. Metachromazja
Metachromazja jest zjawiskiem barwienia się niektórych substancji chemicznych i struktur biologicznych na kolor odmienny od barwy użytego barwnika. Dotyczy to głównie zasadowych barwników tiazynowych (błękit toluidynowy, azur A, tionina). Mechanizm barwienia metachromatycznego polega na tworzeniu w tkance polimerów barwnika o innej barwie (pochłanianie światła o innej długości fali), niż w przypadku formy monomerowej roztworu barwiącego. Polimero-podobne agregaty cząsteczek barwnika tworzą się na skutek periodycznego rozmieszczenia grup chemicznych wiążących barwnik, obecnych w niektórych substancjach, jak np. kwaśne, zwłaszcza sulfonowane glikozoaminoglikany (ryc. 6.3).
6.5. Wykrywanie lipidów
Do histochemicznego wykrywania lipidów używa się głównie barwników wykazujących niską rozpuszczalność w wodzie i alkoholu, natomiast wysoką w tłuszczach (Sudan III, Sudan IV, czerń sudanowa, czerwień oleista). Po zanurzeniu skrawka tkanki zawierającej skupiska lipidów do wodnego lub alkoholowego roztworu jednego z tych barwników, następuje zgodne ze stopniem rozpuszczalności przejście barwnika z fazy rozpuszczalnika do fazy lipidowej. Metoda ta opiera się zatem raczej na procesie fizycznym, niż - jak większość metod histochemicznych - na reakcji chemicznej.
Istnieje także szereg ściśle histochemicznych metod, odznaczających się wyższą swoistością i używanych do różnicowania poszczególnych klas lipidów. Należą tu m.in.:
· reakcja z kwasem fosforomolibdenowym (wykrywa lipidy bogate w cholinę),
· reakcja z dwufenylokarbazonem i rtęcią (wykrywa lecytyny i sfingomieliny),
· reakcja bromkowo-srebrowa (wykrywa lipidy nienasycone),
· reakcja z ftalocyjanianem miedzi (wykrywa fosfolipidy).
6.6. Wykrywanie kwasów nukleinowych
6.6.1. Reakcja Feulgena
Jest to dwuetapowa reakcja służąca do wykrywania DNA. W pierwszym etapie tkankę poddaje się ściśle kontrolowanej hydrolizie w 1N kwasie solnym. Efektem tej hydrolizy jest pęknięcie pierścienia pentozowego dezoksyrybozy i wytworzenie przy II węglu grupy aldehydowej. Powstałe w DNA grupy aldehydowe wykrywa się następnie odczynnikiem Schiffa (ryc. 6.4). Hydroliza nie powoduje analogicznych zmian w cząsteczkach rybozy, stąd reakcja nie uwidacznia RNA.
6.6.2. Metoda Bracheta
Metoda ta służy do różnicowego wykrywania DNA i RNA w tym samym materiale, za pomocą tzw. polichromu Unny, czyli mieszaniny zieleni metylowej i pyroniny. Zieleń metylowa wykazuje stereospecyficzne powinowactwo do DNA (tzn. kształt przestrzenny cząsteczki zieleni metylowej "pasuje" do kształtu fragmentu DNA), natomiast pyronina swoiście wiąże się z RNA. Efektem procedury jest zatem czerwone zabarwienie rejonów komórki bogatych w RNA (jąderko, obszary chromatyny obfitujące w rybosomy) i zielono-fioletowy odcień chromatyny jądrowej (wynikający z nałożenia się barw DNA i RNA). Metoda Bracheta zakłada każdorazową kontrolę barwienia przez wytrawienie części skrawków rybonukleazą. Powoduje to zniknięcie czerwonych (pyroninochłonnych) struktur i zachowanie tylko zabarwionej na zielono chromatyny.
Klasyczne metody histochemiczne umożliwiają jedynie ogólne wykrywanie kwasów nukleinowych. Identyfikację ich odcinków charakteryzujących się ściśle określoną sekwencją nukleotydów zapewnia znacznie bardziej swoista hybrydocytochemia (p. rozdz. 8)
6.6.3. Metody fluorescencyjne
W ostatnich latach dużą popularność zyskało wykorzystanie barwników fluorescencyjnych swoiście wiążących się z DNA (DAPI - dwuaminofenyloindol, Hoechst 33258, Hoechst 33342, jodek propidyny, bromek etydyny). Stosuje się je przede wszystkim do "podbarwiania" jąder komórkowych lub chromosomów w metodach immunofluorescencyjnych (p. rozdz. 7), hybrydocytochemicznych (p. rozdz. 8) i w cytometrii przepływowej (p. rozdz. 11.2).
6.7. Wykrywanie amin biogennych
Do grupy amin biogennych należy szereg niskocząsteczkowych, aktywnych biologicznie związków o charakterze hormonów lub neuromediatorów (adrenalina, noradrenalina, serotonina, dopamina, itp.). Metodą z wyboru przy ich wykrywaniu na poziomie mikroskopu optycznego jest liofilizacja tkanki, a następnie inkubacja liofilizowanego materiału w parach formaldehydu w podwyższonej temperaturze (ok. 80°C). Etap ten łączy w sobie proces utrwalania i reakcji histochemicznej: pary formaldehydu łatwo penetrują liofilizowaną tkankę utrwalając ją, a równocześnie formaldehyd swoiście reaguje z obecnymi w tkance aminami biogennymi, przekształcając je w intensywnie fluoryzujące pochodne. Po zatopieniu (zazwyczaj w parafinie) i pokrojeniu, wyniki reakcji ocenia się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Metoda ta określana jest skrótem FIF (fluorescencja indukowana formaldehydem).
Różne modyfikacje tej metody, a także różnice barwy fluorescencji pozwalają na identyfikację poszczególnych amin biogennych.
6.8. Wykrywanie enzymów
Histochemiczne wykrywanie enzymów nie polega na ich wykazywaniu jako konkretnych substancji (umożliwia to zastosowanie metodyki immunohistochemicznej), lecz na uwidocznieniu produktów ich aktywności. Wykrywany enzym musi zatem być czynny - stąd należy zwrócić szczególną uwagę na odpowiednie przygotowanie tkanki do badań: utrwalanie czy też inne procedury wstępne nie mogą powodować istotnego zahamowania aktywności enzymatycznej.
Do środowiska reakcji wprowadzamy substrat(y), które ulegają przemianie w barwny (lub elektronowo gęsty) strąt pod wpływem katalitycznej funkcji wykrywanego enzymu.
6.8.1. Inkubacja
Reakcję histochemiczną prowadzącą do wykrycia aktywności enzymu nazywamy inkubacją, a środowisko reakcji - płynem inkubacyjnym. Płyn inkubacyjny powinien zawierać specyficzny dla wykrywanego enzymu substrat oraz - jeżeli metoda tego wymaga - dodatkowe składniki biorące udział w reakcji barwnej, koenzymy, jony stymulujące aktywność badanego enzymu, itp. pH i temperatura płynu inkubacyjnego winny odpowiadać optymalnym warunkom działania enzymu. Z uwagi na fakt, iż produkt reakcji histochemicznej jest wytwarzany przez cały czas inkubacji, jego ilość stopniowo wzrasta i w każdej reakcji należy dobrać optymalny czas trwania inkubacji.
Istnieje kilka podstawowych typów reakcji histochemicznych wykrywających aktywność enzymów (podane poniżej przykłady oczywiście nie przedstawiają całości metodycznego repertuaru histochemii enzymów).
6.8.2. Reakcja precypitacji z kationami metali (reakcja Gomoriego)
Służy do wykrywania hydrolaz. Reakcja polega na wstępnym rozszczepieniu substratu przez wykrywany enzym obecny w tkance, a następnie na wytrąceniu jednej ze składowych rozszczepionego substratu jonami metali (Ca2+, Pb2+, Cu2+, Ba2+, Co2+), które utworzą z nią nierozpuszczalną sól (ryc. 6.5). Większość takich soli jest widoczna w mikroskopie elektronowym, natomiast do celów mikroskopii świetlnej należy przeprowadzić jeszcze dodatkową reakcję barwną.
...
carambola