ZESTAWIENIE ZAWARTOŚCI PRZECIWUTLENIACZY (ANTYOKSYDANTÓW)
W WYBRANYCH PRODUKTACH SPOŻYWCZYCH
http://jn.nutrition.org/cgi/content/full/132/3/461
A Systematic Screening of Total Antioxidants in Dietary Plants.
(Systematyczne oznaczanie całkowitej zawartości przeciwutleniaczy w roślinach jadalnych)
Bente L. Halvorsen*, Kari Holte*, Mari C. W. Myhrstad*, Ingrid Barikmo**, Erlend Hvattum, Siv Fagertun Remberg, Anne-Brit Wold, Karin Haffner, Halvard Baugerød, Lene Frost Andersen*, Ø. Moskaug*, David R. Jacobs, Jr. and Rune Blomhoff**
The American Society for Nutritional Sciences: Journal of Nutrition 2002, 132, pp 461-471.
* Institute for Nutrition Research, Faculty of Medicine, University of Oslo, Blindern, 0316 Oslo, Norway;
** Akershus University College, Bekkestua, Norway; Agricultural University of Norway, Ås, Norway; and the Division of Epidemiology, School of Public Health, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55454
Kontakt, E-mail: rune.blomhoff@basalmed.uio.no
Tłumaczył: Aleksander Kwiatkowski
ABSTRAKT
Dieta w oparciu w większości o produkty roślinne zmniejsza ryzyko powstawania wielu chorób zwyrodnieniowych. Często zakłada się, że przeciwutleniacze (antyoksydanty) przyczyniają się do tej ochrony, ale wyniki badań dotyczące podowania pojedynczego rodzaju przeciwutleniacza w formie suplementów, nie potwierdzają tego rodzaju korzyści zdrowotnych. Ponieważ rośliny jadalne zawierają kilkaset różnych rodzajów przeciwutleniaczy, staje się użyteczne mieć informacje o całkowitym stężeniu donorów elektronów, jakimi są przeciutleniacze (reduktanty), w poszczególnych rodzajach materiału roślinnego. Tego rodzaju dane mogą być przydatne w identyfikacji roślin, które działają najbardziej korzystnie na nasze zdrowie. W niniejszych badaniach systematycznie oznaczono całkowite stężenie przeciutleniaczy (antyoksydantów) w różnorodnych produktach spożywczych pochodzenia roślinnego, produktach spożywanych na całym świecie, włączając w to liczne rodzaje owoców, jagód, warzyw, roślin zbożowych, orzechów i roślin strączkowych. O ile to było możliwe, staraliśmy się, przebadać trzy lub więcej próbek roślin jadalnych, pochodzących z trzech różnych regionów geograficznych świata. Całkowita stężenie przeciwutelniaczy, zostało wykonane w oparciu o redukcję jonów żelazowych (Fe3+) do jonów żelazawych (Fe2+) za pomocą metody FRAP, taka reakcja zachodzi szybko i ze wszystkimi związkami redukującymi, zgodnie reakcją połówkową potecjału redoks z Fe3+ do Fe2+. Zatem, uzyskane wartości zostały wyrażone stężeniem donorów elektronów, pochodzących od przeciwutleniaczy. Nasze wyniki wskazują, że istnieją duże różnice, różnice przekraczające 1000-krotnie stężenia, pomiędzy różnymi gatunkami roślin jadalnych. Gatunki zawierające najwięcej przeciwutleniaczy, należące do kilkunastu rodzin botanicznych t.j. Rosaceae (róża dzika, wiśnia, jeżyna, truskawka, malina), Empetraceae t.j. bażyna, Ericaceae t.j. jagoda, Grossulariaceae t.j. czarna porzeczka, Juglandaceae t.j. orzech włoski, Asteraceae t.j. słonecznik, Punicaceae t.j. granat, Zingiberaceae t.j. imbir.
W diecie Norweskiej owoce, jagody i zbożowe zajmują odpowiednio 43,3%, 27,1% i 11,7% całkowitej ilości przeciwutleniaczy pochodzących z produktów roślinnych. Warzywa obejmują zaledwie 8,9%. Systematyczna analiza zaprezentowana w niniejszej pracy, umożliwi w przyszłości przeprowadzenie wnikliwszych badań, z zakresu dietetycznej roli zbiorowego wpływu przeciwutleniaczy, zawartych w spożywanych roślinach.
Słowa kluczowe: antioxidants, berries, fruits, vegetables, diet, humans
WSTĘP
Ogólnie, od kilku lat, istnieje zgodność w odniesieniu do diety, że jej rodzaj odgrywa główną rolę w powstawaniu chorób chronicznych n.p. nowotwory, choroby serca i naczyń wieńcowych, otyłość, cukrzyca typu 2, nadciśnienie, zaćma [1-9]. Zgodnie sugeruje się, że dieta w skład której wchodzą przede wszystkim, artykuły pochodzenia roślinnego, dieta bogata w owoce i warzywa, rośliny strączkowe i pełne produkty skrobiowe, spożywane codziennie, znacząco zmniejsza ryzyko powstawania tego rodzaju schorzeń. Zalecenia, które opierają się głównie na badaniach epidemiologicznych wskazują, że owoce, warzywa i pełne małoprzetworzone produkty roślinne, dostarczają najlepszej ochrony przeciwko powstawaniu chorób degeneracyjnych, z niewielką lub bez żadnego zalecenia pobierania dodatkowych suplementacji witaminowych lub mineralnych by zapobiegać tego rodzaju schorzeniom [1-9]. Jest to zasada bezpieczna, umożliwiająca i gwarantująca poprawę zdrowia ogółu ludności. Jakkolwiek, powyższe ogólne rekomendacje unikają pewnego zagadnienia a mianowicie, które z gatunków roślin powinno się spożywać w większych ilościach. Dużym i czekającym wyzwaniem jest rozpoznanie najlepszych gatunków roślin dla naszej diety, roślin które mają najbardziej korzystny wpływ zdrowotny. Z drugiej strony, pełne zrozumienie etiologii powstawania tego rodzaju schorzeń, to wszystko co mogło by posłużyć do identyfikacji substancji występujących w roślinach, substancji chroniących przed tymi schorzeniami oraz rozpoznanie mechanizmów biochemicznych stojących za ich ochronnym działaniem.
Wspólnym mianownikiem w patogenezie większości chorób chronicznych jest stres oksydacyjny, powiązany z wytwarzaniem przez wszystkie organizmy tlenowe, reaktywnych związków tlenu i azotu, włączając w to wolne rodniki [10-15]. Na dodatek, tak reaktywne związki spełniają pewne funkcje wewnątrz- i zewnątrzkomórkowe, mogą przez to inicjować cały szereg szkodliwych reakcji biochemicznych [14-16]. W odpowiedzi na tego rodzaju uszkodzenia, powstaje skomplikowana obrona metaboliczna w postaci przeciwutleniaczy a dostarczanie wraz z dietą przeciwutleniaczy, stanowi kluczową rolę w tej obronie [17-20].
Chociaż często zakłada się, że przeciwutleniacze zawarte w spożywanych roślinach, chronią przeciwko schorzeniom powstającym w wynku stresu oksydacyjnego, wyniki badań z użyciem pojedynczych, często syntetycznych form przeciwutleniaczy t.j. witamina E, witamina C lub beta-karoten, nie potwierdzają ich ochronnego działania [13, 17-22]. Dodatkowo, eksperymentalna suplementacja czystym beta-karotenem w badaniach klinicznych, powodowała efekty odwrotne do zamierzonych, w leczeniu chorób chronicznych [23-26]. Jednym z powodów braku wymaganego efektu, w tych badanich mogło być to, że efekty ochronne owoców i warzyw są wynikiem działania, albo mniej znanych związków – przeciwutleniaczy, lub że jest to wspólne działanie, coś w rodzaju koktailu wielu przeciwutleniaczy, znajdujących się w nieprzetworzonych produktach roślinnych. To było by zgodne z obserwacjami dokonanymi na roślinach takich jak brukselka, cebula i pomidory [27-30], natomiast pojedynczy przeciwutleniacz, taki jak beta-karoten, witamina E, witamina C lub koenzym Q10 są w stanie zmniejszać uszkodzenia DNA, połączonego z biomarkerami, uszkodzenia powstałego w wyniku działania wolnych rodników, badanie poprzez analizę moczu lub stopnia uszkodzenia lymfocytów u ludzi [18, 21, 22, 31, 32].
Wspólne działanie licznych, dietetycznych przeciwutleniaczy może również powodować spodziewane wyniki, biorąc pod uwagę złożoną strukturę tych związków. Organizm człowieka, jego tkanki, komórki i makromolekuły składają się z partycji, zawierających cały szereg różnych warunków fizycznych, anatomicznych, faz wodno-lipidowo-białkowych. Wewnątrz tych faz i na granicach pomiędzy fazami, mają miejsce różnorodne warunki fizykochemiczne t.j. pH, siła jonowa, ciśnienie osmotyczne, ładunek i stężenie związków chemicznych. Powyższa różnorodność będzie miała wpływ na możliwości tych faz, oddziaływanie rozpuszczalnika i substancji rozpuszczonej, t.j. przeciwutleniaczy rozpuszczalnych w lipidach i wodzie. Ponieważ niektóre przeciwutleniacze rozpuszczalne w wodzie, wykazują niskie wartości rozpuszczalności w fazie lipidowej, ich wchodzenie lub retencja w fazie wodnej, będą uzależnione od ich stałej rozpuszczalności pKa i od zmian pH na granicy błon (lipidowo-białkowych). Dodatkowo, przeciwutleniacze zarówno hydrofobowe jaki i hydrofilowe, mogą być rozmieszczone pomiędzy wodną i lipidową fazą, w zależności o względnego stężenia, przestrzennego ułożenia i ilości grup hydrofilowych i hydrofobowych w danym związku. Ich rozpuszczalność jest dodatkowo modyfikowana, w przypadku powiązania cząsteczki przeciwutleniacza z innymi, bardziej złożonymi substancjami t.j. białkami.
Teoretycznie istnieje możliwość, że przeciwutleniacze różniące się rozpuszczalnością, są w stanie regenerować sąsiadujące przeciwutleniacze w sposób zintegrowany i komplementarny. Takie oddziaływania, stwierdzono in vitro dla tokoferolu, tokotrienolu, witaminy C, kwas liponowego, i związków. tiolowych [20], ale ta koncepcja może mieć również szersze zastosowanie, jak to zasugerowano w innych badaniach [33]. Wszystko to tworzy perspektywę istnienia układu różnorodnych przeciwutleniaczy, przeciwutleniaczy które są konieczne dla utrzymania właściwego poziomu reakcji redoks w środowiskach niehomogenicznych, środowiskach jakie występują systemach biologicznych. To mogło by być podobne do skoordynowanych reakcji utleniania i redukcji, reakcji zachodzących na łańcuchu oddechowym w mitochodriach.
Ilości lepiej poznanych przeciwutleniaczy t.j. tokoferoli (witamina E), witamina C oraz beta-karotenu w roślinach jadalnych, zostały szczegółowo opracowane. Jakkolwiek, obecne dane mogą sugerować, że względnie mała część przeciwutleniaczy, w większości spożywanych roślinach, jest związana z tymi dobrze poznanymi przeciwutleniaczami [34, 35].
Chociaż było by znacznie prościej zbadać efekt ochronny pojedynczego przeciwutleniacza lub określonych rodzajów przeciwutleniaczy, niewykluczone, że nigdy nie znajdziemy tego rodzaju powiązań, jeżeli w rzeczywistości jest to sprawa liczby, i to setek rodzajów przeciwutleniaczy, dostarczanych wraz z dietą t.j. karotenoidów, kwasków polifenolowych (pochodne flawonoidów), sulfidów, flawonów, lignanów itd. które są biologicznie aktywne i pracują synergistycznie. Zatem, całkowita ilość dawców elektronów jakimi są przeciwutleniacze (reduktanty), pobierane wraz z dietą, występujących w kombinacjach wielu, różnych rodzajów przeciwutleniaczy, substancji naturalnie występujących w pożywieniu, przez co ta koncepcja może być znacznie lepsza niż koncepcja określonego, pojedynczego rodzaju przeciwutleniacza, pobieranego wraz z pożywieniem.
W poprzednich badaniach nad antyoksydantami, zastosowano trzy metody, w celu określenia całkowitej pojemności przeciwutleniającej (redukującej) w kilku rodzajach roślin. Związek o nazwie kwas 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylchroman-2-karboksylowy (Trolox) jest równoważnikiem pojemności przeciwutleniającej (TEAC)3 metody zastosowanej przez Millera i innych [36], właściwości redukujące jonów żelazowych (Fe3+) przez przeciutleniacze zawarte w protoplazmie (FRAP) zastosowaną przez Benzie i Strain [37], oraz absorbancję rodnika tlenowego (ORAC) metoda zastosowana przez DeLange i Glazera [38] oraz innych badaczy [39]. Metoda TEAC i ORAC, opierają się na reakcji przeciutleniaczy z wolnymi rodnikami, rodnikami które są generowane przez odczynniki zastosowane w tych metodach, podczas gdy metoda FRAP opiera się na redukcji jonów żelazowych (Fe3+) do jonów żelazawych (Fe2+) w obecności przeciwutleniaczy. Ponieważ redukcja jonów żelazowych zachodzi bardzo szybko ze wszystkimi reduktorami (przeciwutleniaczami), zgodnie reakcją połówkową redukcji (potencjału elektrochemicznego), potecjał o wyższej od Fe3+/Fe2+ wartości FRAP będą zatem wyrażone wg. stężenia donorów elektronów, jakimi są przeciwutleniacze.
Wybraliśmy metodę FRAP do naszej analizy z kilku powodów. Metoda FRAP to jedyna metoda, która umożliwia bezpośredni pomiar stężenia przeciwutleniaczy (reduktorów) w próbce. Inne metody są metodami bardziej pośrednimi, ponieważ opierają się na inhibicji reaktywnych związków (wolnych rodników) generowanych w mieszanine, w której zachodzi reakcja, takie wyniki są również bardzo uzależnione od rodzaju reagującego związku. W przeciwieństwie do metody FRAP, w której przeciwutleniacze są bezpośrednimi reduktorami w reakcji redoks, sprzężonej z reakcją barwną, umożliwiającą pomiar kolorymetryczny. Dodatkowo, w innych metodach ale nie FRAP, stosuje się pomiar w opraciu o okres latencji (ang. lag phase). Jest wtedy trudno utworzyć stabilny standard dla innych eksperymentów, co powoduje otrzymywanie zróżnicowanych wyników pomiędzy różnymi laboratoriami. W metodzie FRAP nie ma potrzeby dodatkowego, wstępnego przygotowywania, czynniki stochiometryczne są stałe i zachowują liniowość w szerokim zakresie stężeń. Jedyną ujemną stroną metody FRAP może być to, że nie reagują w niej związki tiolowe, ponieważ potencjał elektrochemiczny reakcji redukcji dla zw. tiolowych jest poniżej wartości potencjału elektrochemiczenego, połówkowej reakcji redukcji Fe3+/Fe2+. Jakkolwiek, tylko niewielkie i ograniczone ilości związku takiego jak n.p. glutation, pobierane ze spożywanych roślin, są wchłaniane przez organizm człowieka [40], prawie żadne inne tiolowe przeciwutleniacze nie występują w roślinach jadalnych, za wyjątkiem czosnku (zobacz niżej); metoda FRAP może być metodą najlepszą z dotychczasowych aby posłużyć do oznaczenia całkowitej ilości przeciwutleniaczy w roślinach.
W niniejszych badaniach, systematycznie określiliśmy całkowite stężenia wszystkich związków redukujących, donorów elektronów, w plazmie (sokach) różnorodnych gatunkach roślin jadalnych. Niniejsze wyniki, wraz z dalszymi badaniami nad biodostępnością, jak również wpływem metod przetwarzania żywności, pozwolą na poszerzanie możliwości oceny dietetycznej przeciwutleniaczy, umożliwią określenie rodzajów powiązań przeciwutleniczy z hamowaniem procesów patologicznych w organizmie.
METODY
Reagenty.
2,4,6-tri-pyridyl-s-triazyna (TPTZ) zakupiono od firmy Fluka Chemie AG (Deisenhofen, Szwajcaria), octan sodowy trihydrat i FeSO4 x 7 H2O zakupiono od firmy Riedel-deHaën AG (Seelze, Niemcy), kwas octowy i kwas solny zakupiono od firmy Merck (Darmstadt, Niemcy), FeCl3 x 6 H2O pochodzi z BDH Laboratory Supplies (Dorset, Anglia), woda zdemineralizowana MilliQ (Millipore, Bedford, MA), methanol do HPLC od firmy Merck, używany we wszystkich ekstrakcjach, 2-propanol do HPLC również pochodził od firmy Merck.
Zautomatyzowana metoda FRAP.
Metoda FRAP została użyta do pomiaru całkowitego stężenia przeciwutleniaczy. Metoda ta została zastosowana w ekstraktach zgodnie ze standardami opisanymi przez Benzie i Strain [37], za wyjątkiem tego, że próbki nie były rozcieńczane wodą podczas pomiarów. Do analizy użyto instrumentu: Technicon RA 1000 system (Technicon Instruments Corporation, N. York, NY) do pomiaru zmian aborpcji jakie miały miejsce podczas redukcji kompleksu TPTZ-Fe3+ w TPTZ-Fe2+ w obecności przeciwutleniaczy. Uzyskane intensywne niebieskie zabarwienie w zakresie fali 593 nm, maksimum absorpcji. Pomiaru dokonano na długości fali 600 nm. Wodny roztwór 1000 µmol/L FeSO4 x 7 H2O został użyty do kalibracji instrumentu.
Przygotowanie próbek.
Rośliny jadalne zostały zidentyfikowane i sklasyfikowane wg. standardów botanicznych [41-43]. Próbki różnych, komercyjnie dostępnych roślin jadalnych, uzyskano ze sklepów owocowo-warzywnych lub marketów z kilkunastu krajów (info podano w Tabelach 1-8). Niektóre produkty były również uprawiane w Akademii (na Uniwersytecie Rolniczym) w Norwegii (Ås, Norway). Dzikie jagody zebrano z miejsc jakie zostały opisane w Tabelach. Wszystkie rośliny jadalne zostały bezpośrednio przeanalizowane, przechowywane w 4°C przez kilka dni lub zamrożone w -20°C przed dokonaniem analizy.
Suche próbki t.j. ziarna zbóż i innych roślin zostały zmielone, pobrano 0,1-0,2 g i dodano 1 mL wody. Próbki twardych owoców i warzyw zostały zmiksowane w mikserze wraz z określoną ilością wody aż do uzyskania odpowiedniej gęstości, niezbędnej do celów pipetowania. Metanol (9 mL) dodano do 1 mL homogenatu, następnie próbki mieszano i poddano sonifikacji (ultradźwięki) w łaźni wodnej o temperaturze 0°C, przez 15 minut. Trzy próbki o pojemności 1,5 mL z każdej serii, poddano ultrawirowaniu (12402 x g) przez 2 minuty w temperaturze 4°C. Całkowite stężenie przeciwutleniaczy zostało pomierzone potrójnie, w każdej próbce supernatantu (warstwy górnej, klarownej, odwirowanej próbki).
Analiza wyników metody FRAP
...
jedrus1a