TYPOWANIE MOLEKULARNE W DOCHODZENIU EPIDEMIOLOGICZNYM.pdf

TYPOWANIE

MOLEKULARNE

W DOCHODZENIU

EPIDEMIOLOGICZNYM

Stefania Giedrys-Kalemba

Podstawowym zadaniem zespołu kontroli zaka˙e´ jest prowadzenie

systematycznego nadzoru i rejestracji zaka˙e´ w celu okre´lenia na

poszczeg´ lnych oddziałach poziomu i ryzyka zaka˙e´ , szczeg´ lnie o cha-

rakterze epidemicznym. Analiza epidemiologiczna r´ ˙nych danych zbie-

ranych przez członk´w zespołu i personel oddział´w opracowana w opar-

ciu o zalecane wska´niki epidemiologiczne, w tym wyniki dochodzenia

epidemiologicznego prowadzonego w ogniskach epidemicznych, sta-

nowi podstaw˛ wprowadzenia lub weryfikacji procedur eliminuja˛cych

lub przynajmniej ograniczaja˛cych ryzyko wysta˛pienia zaka˙enia szpi-

talnego.

Jednym z element´w nadzoru nad zaka˙eniem jest nadz´ r mikrobiolo-

giczny. Celem nadzoru mikrobiologicznego jest analiza czynnik´w etiologi-

cznych i ich wra˙liwo´ci na antybiotyki r´˙nych form klinicznych zaka˙e´ .

Izolacja i identyfikacja czynnika etiologicznego zaka˙enia (przynaj-

mniej do gatunku) oraz okre´lenie jego wra˙liwo´ci na antybiotyki wraz

z wykryciem mechanizmu oporno´ci nale˙y do podstawowych zada´

laboratorium mikrobiologicznego. Obok klasycznych metod hodowli

uwa˙anych za ,,złoty standard’’ w diagnostyce mikrobiologicznej wykony-

wane sa˛ r´wnie˙ badania serologiczne, polegaja˛ce na wykryciu antygenu

lub swoistych dla danego drobnoustroju przeciwciał, jednak w dochodze-

niu epidemiologicznym maja˛ one mniejsze znaczenie.

Do dodatkowych zada´ laboratorium zwia˛zanych z kontrola˛ zaka˙e´

szpitalnych nale˙y przekazywanie okresowych raport´w o czynnikach

etiologicznych zaka˙e´ i lekooporno´ci drobnoustroj´w w oddziałach,

monitorowanie mechanizm´w oporno´ci drobnoustroj´w alarmowych,

udział w dochodzeniu epidemiologicznym.

Do wa˙niejszych drobnoustroj´w alarmowych nale˙a˛: metycylino-

oporne gronkowce złociste (MRSA), enterokoki o wysokiej oporno´ci na

aminoglikozydy (HLAR) i oporne na wankomycyn˛ (VRE), pałeczki

Gram-ujemne wytwarzaja˛ce b-laktamazy typu ESBL, AmpC czy metalo-

110

enzymy, oporne gatunki Candida . W codziennej praktyce do patogen´w

alarmowych mo˙na zaliczy´ ka˙dy gatunek, kt´ ry w warunkach danego

oddziału czy szpitala wywoła zaka˙enie o charakterze epidemii lub

wyst˛puje endemicznie. Systematyczne narastanie oporno´ci drobnoustro-

j´w na antybiotyki, zmienno´´ czynnik´w etiologicznych zaka˙e´ , wzrost

zaka˙e´ oportunistycznych i dodatkowych czynnik´w ryzyka zaka˙enia

zwia˛zanych z inwazyjna˛ diagnostyka˛ i leczeniem wymagaja˛ obecnie

prowadzenia stałej i profesjonalnej kontroli ekosystemu szpitala oraz

rejestracji zaka˙e´ , szczeg´ lnie wywołanych przez patogeny alarmowe.

Ze wzgl˛du na te problemy niezb˛dna jest ´cisła wsp´ łpraca laborato-

rium mikrobiologicznego z personelem medycznym oddział´w oraz

zespołem kontroli zaka˙e´ . Wyniki nadzoru epidemiologicznego w poła ˛ -

czeniu z analiza ˛ czynnik´w etiologicznych zaka˙enia i ich wra˙liwo´ci na

leki pozwalaja˛ na ocen˛ zagro˙enia epidemicznego w oddziale/szpitalu

i wdro˙enia procedur post˛powania zapobiegawczego. Sa˛ tak˙e podstawa˛

do opracowania receptariusza szpitalnego, profilaktyki okołooperacyjnej

i zasad terapii empirycznej w oddziałach.

Zasady doboru materiału do bada´

epidemiologicznych

Dochodzenie epidemiologiczne w ognisku epidemicznym ma na celu

okre´lenie przyczyn powstania epidemii, wygaszenie ogniska i wprowa-

dzenie działa´ zapobiegawczych. Obejmuje r´wnie˙ mikrobiologiczne

opracowanie ogniska: wykrycie czynnika etiologicznego zaka˙enia u cho-

rych, ustalenie ´r´dła i dr´g szerzenia si˛ zaka˙e´ oraz utrzymywania si˛

szczep´w epidemicznych czy endemicznych w ´rodowisku. Cz˛sto wyma-

ga przeprowadzenia dodatkowych bada´ mikrobiologicznych ´rodowiska

oraz wykrycia nosicielstwa drobnoustroj´w patogennych u personelu i in-

nych pacjent´w, a nast˛pnie okre´lenia pokrewie´ stwa szczep´w izolo-

wanych z r´˙nych pr´bek — od chorych i personelu oraz ze ´rodowiska.

Wła´ciwe pobranie i transport materiału jako pierwszy etap badania

mikrobiologicznego jest niezwykle istotnym elementem decyduja˛cym

o sukcesie i wiarygodno´ci hodowli drobnoustroj´w, jednak ka˙dy etap

badania mikrobiologicznego ma wpływ na ostateczny wynik badania, jego

interpretacj ˛ kliniczna ˛ i epidemiologiczna ˛ .

Najwi˛ksza˛ warto´´ diagnostyczna˛ w wykrywaniu czynnika etiolo-

gicznego zaka˙enia maja˛ pr´bki materiał´w fizjologicznie jałowych, jak:

krew, płyn m´ zgowo-rdzeniowy i inne płyny ustrojowe (opłucnowy,

stawowy, otrzewnowy), punktaty i aspiraty z ropni gł˛bokich, bronchoas-

piraty, popłuczyny oskrzelowe. Dodatnie posiewy wymaz´w z miejsca

operowanego, miejsca wprowadzenia cewnika, g´ rnych dr´g oddecho-

111

wych, a tak˙e moczu, kału czy plwociny zawsze wymagaja ˛ dokonania

analizy pod ka˛tem obecno´ci flory fizjologicznej, nosicielstwa drobno-

ustroj´w patogennych czy przypadkowej kolonizacji. Materiały kliniczne

nale˙y pobiera´ w ostrym okresie choroby lub w okresie zaostrzenia, przed

podaniem antybiotyku.

Badanie personelu lub innych chorych bez objaw´w zaka˙enia w kie-

runku nosicielstwa epidemicznych drobnoustroj´w nale˙y wykona´ w mo-

˙liwie jak najkr´ tszym czasie od momentu podejrzenia ogniska epidemicz-

nego. Najcz˛´ciej pobiera si˛ pr´bki z przedsionka nosa, jamy nosowo-

-gardłowej, wybranych okolic sk´ ry, kał.

Tak˙e pr´bki ze ´rodowiska, sprz ˛ tu lub pokarmu pobiera si ˛ w okresie

wysta ˛ pienia zaka˙e´ krzy˙owych, ewentualnie cyklicznie w przypadku

zaka˙e´ endemicznych.

Szczeg´ łowe zasady pobierania i transportu materiał´w do bada´

mikrobiologicznych zawarte sa˛w licznych opracowaniach. Przygotowanie

odpowiednich procedur dotycza˛cych poszczeg´ lnych oddział´w szpitala

nale˙y do obowia˛zk´w wsp´ łpracuja˛cego ze szpitalem laboratorium

mikrobiologicznego.

Metody stosowane w dochodzeniu

epidemiologicznym

Wdochodzeniu epidemiologicznym niezwykle wa˙ny jest dob´ r wła´ciwej

techniki typowania okre´lonego gatunku szczep´w izolowanych od cho-

rych i nosicieli oraz ze ´rodowiska, np. szczep´w MRSA. Wykazanie

identycznych cech badanych szczep´wMRSA pozwala zaliczy´ je do tego

samego klonu i potwierdza epidemiczny, krzy˙owy charakter wywoływa-

nych przez nie zaka˙e´ . W powia˛zaniu z danymi klinicznymi, wy-

st˛powaniem u nosicieli i innymi danymi epidemiologicznymi typowanie

szczep´w umo˙liwia ustalenie potencjalnych rezerwuar´w drobnoustro-

j´w patogennych i mo˙liwo´ci ich rozprzestrzeniania si˛, a w efekcie

weryfikacj˛ odpowiednich procedur post˛powania.

Optymalna metoda wewna˛trzgatunkowego r´˙nicowania szczep´wpo-

winna by´ prosta i szybka w wykonaniu, tania, wmiar˛ uniwersalna, ale spe-

cyficzna, dawa´ wiarygodne wyniki, powtarzalne w r´˙nych laboratoriach.

Wdochodzeniu epidemiologicznym do ustalenia pokrewie´ stwa szcze-

p´wwykorzystuje si˛ klasyczne metody mikrobiologiczne oparte na ocenie

cech fenotypowych drobnoustroj´w oraz nowoczesne metody molekularne

analizuja˛ce materiał genetyczny organizmu, unikatowy i stały w por´w-

naniu z cechami fenotypowymi, kt´ re moga˛ by´ modyfikowane przez

czynniki ´rodowiskowe. Wszystkie metody maja˛ swoje wady i zalety,

trudno znale´´ metod˛ idealna˛.

112

Metody fenotypowe

W rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej r´ ˙nicowanie drobnoustro-

j´w i okre´lenie gatunku przeprowadza si˛ gł´wnie na podstawie analizy

cech fenotypowych. Na odpowiednich zestawach podło˙y stosowanych do

poszczeg´ lnych materiał´w klinicznych lub innych pr´bek ocenia si ˛

wzrost i morfologi ˛ kolonii, ewentualnie niekt´ re cechy biochemiczne

(podło˙a wybi´ rczo-r´˙nicuja˛ce) oraz morfologi˛ kom´ rek (wykorzystuje

si˛ gł´wnie metod˛ barwienia Grama). Nast˛pnie przeprowadza si˛

ukierunkowane badanie cech biochemicznych drobnoustroju, kt´ re cz˛sto

pozwala na okre´lenie rodzaju lub gatunku. Niekiedy ustalenie gatunku

wymaga dodatkowo wykonania badania serologicznego wykorzystuja˛cego

swoiste surowice odporno´ciowe dla wybranych antygen´w drobnoustroju

(tzw. typowanie serologiczne), rzadziej wykrycia zdolno´ci wytwarzania

toksyny.

Uznanie drobnoustroju za czynnik etiologiczny zaka˙enia wia˛˙e si˛

z okre´leniem jego wra˙liwo´ci na antybiotyki i mechanizm´w oporno´ci

w celu zastosowania optymalnego leczenia. Wykonanie antybiogramu

powinno by´ przeprowadzone zgodnie z obowia˛zuja˛cymi standardami

i rekomendacjami, aktualizowanymi praktycznie ka˙dego roku.

Spo´r´d rutynowych metod mikrobiologicznych do por´wnania szcze-

p´w tego samego gatunku i serotypu w dochodzeniu epidemiologicznym

stosuje si˛ najcz˛´ciej wzory antybiogram´w, rzadziej profil bioche-

miczny. Do metod stosowanych gł´wnie w badaniach epidemiologicz-

nych nale˙y typowanie fagowe, wykorzystuja˛ce odpowiednie zestawy

bakteriofag´w litycznych oraz typowanie bakteriocynowe, okre´laja˛ce

zdolno´´ wytwarzania przez dany szczep bakteriocyn i wra˙liwo´c´na

okre´lone bakteriocyny. Dobre mo˙liwo´ci typowania i r´˙nicowania

szczep´w daja˛ metody stosowane w badaniach naukowych, jak analiza

profili białkowych całych kom´ rek, typowanie izoenzymatyczne, im-

munobloting.

W celu dokładnego zidentyfikowania szczep´w cz˛sto konieczne jest

korzystanie z kilku metod fenotypowych jednocze´nie. Sa ˛ one do´´ ko-

sztowne i pracochłonne, maja ˛ r´˙na ˛ powtarzalno´´ wynik´w i mo˙liwo´ci

r´˙nicowania. Moga˛ by´ trudne i niejednoznaczne w interpretacji, szcze-

g´ lnie w przypadku szczep´w o charakterze endemicznym oraz izolo-

wanych z r´ ˙nych oddział´w lub szpitali. Powszechnie obserwuje si˛

zjawisko zmienno´ci fenotypowej szczep´w — obecno´´ lub brak danej

cechy fenotypowej jako ekspresji genu mo˙e by´ modyfikowana przez

warunki ´rodowiskowe (specyfika oddziału, wykonywane zabiegi, stoso-

wane ´rodki dezynfekcyjne, antybiotyki), a tak˙e czynniki zwia˛zane

z chorym (miejsce zaka˙enia, obecno´´ konkuruja˛cej flory fizjologicznej,

mechanizmy obronne, stosowane leki).

113

Metody genotypowe

Rozw´ j biologii molekularnej w ostatnich dziesi˛cioleciach stał si˛

znakomitym uzupełnieniem, a nawet alternatywa˛ dla tradycyjnej diagnos-

tyki mikrobiologicznej. Metody genetyczne umo˙liwiaja˛ znaczne skr´ ce-

nie czasu trwania tradycyjnego post˛powania diagnostycznego, a co

najwa˙niejsze, pozwalaja˛ nie tylko na dokonanie bardziej precyzyjnego

i jednoznacznego r´ ˙nicowania gatunkowego, ale r´wnie˙ na wykazanie

zr´˙nicowania szczep´w w obr˛bie gatunku. Opieraja˛ si˛ na poszukiwaniu

lub analizie unikatowych sekwencji DNA lub RNA charakterystycznych

dla okre´lonego drobnoustroju. R´ ˙norodno´´ układu fragment´w kwas´w

nukleinowych tworza ˛ cych polimorfizm wewna ˛ trzgatunkowy wynika z po-

wszechnie zachodza ˛ cych w naturze proces´w rearan˙acji sekwencji

nukleotydowych, insercji lub delecji pojedynczych par zasad. Metody

genotypowe sa ˛ niezale˙ne od warunk´w ´rodowiskowych, bardziej po-

wtarzalne i wykazuja˛wi˛ksza˛ zdolno´´r´˙nicuja˛ca˛ w obr˛bie gatunku ni˙

metody fenotypowe.

Metody genetyczne stosuje si ˛ wr´˙nych celach:

Þ do identyfikacji bakterii, wirus´w, grzyb´w, pierwotniak´w w mate-

riale klinicznym in situ lub po izolacji ( Mycobacterium , Chlamydo-

phila pneumoniae , Chlamydia trachomatis , Neisseria gonorrhoeae ,

Borrelia burgdorferi , Legionella pneumophila , Clostridium difficile ,

Ehrlichia , Candida , HBV, HCV, CMV, HSV),

Þ do identyfikacji gen´w oporno´ci na antybiotyki ( mec A, erm B, mef A,

gyr A, kat A, rpo B),

Þ do identyfikacji gen´w koduja ˛ cych czynniki wirulencji (toksyny

Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes , Clostridium dif-

ficile , Escherichia coli , Bacillus anthracis , Helicobacter pylori ),

do precyzyjnej analizy ewolucyjnej i filogenetycznej oraz ostatecznej

taksonomii drobnoustroj´w,

w epidemiologii szpitalnej do typowania szczep´ww obr˛bie gatunku

w celu ustalenia ´r´dła zaka˙enia i transmisji szczep´w epidemicz-

nych/endemicznych na oddziale, r´wnie˙ do por´wnywania szcze-

p´w izolowanych od tego samego chorego z r´˙nych materiał´w lub

wr´˙nym czasie.

Techniki biologii molekularnej wykorzystywane

w badaniach epidemiologicznych

Metody genotypowania szczep´w do cel´w epidemiologicznych wykorzy-

stuja˛ najcz˛´ciej techniki oparte na analizie restrykcyjnej całego materiału

genetycznego drobnoustroju lub polegaja˛ce na amplifikacji (powieleniu)

114

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: