sprawko białka.doc

Paulina Krzemińska                                                                                                                                 30.11.2011r.

Sprawozdanie z ćwiczenia 4:
Frakcjonowanie i oznaczanie białek mleka.

1.      Etapy procesu:

1. 1. Wytrącanie kwasem octowym kazeiny, a następnie jej odsączenie (stanowi ok. ¾ białek mleka, więc musimy się jej pozbyć, aby później móc dokładnie oznaczyć zawartość albumin i globulin); w przesączu znajdowało się 25 ml serwatki.
   2. Wytrącenie osadu globulin roztworem (NH4)2SO4 i odwirowanie go w celu oddzielenia go od albumin.
   3. Dalsze nasycanie roztworu znad osadu, prowadzi do wytrącenia się osadu albumin, które również odwirowujemy.

2.      Oznaczanie białek metodą Bradforda:

Jest to spektrofotometryczna metoda opierająca się na krzywej kalibracyjnej, którą tworzymy na podstawie pomiarów roztworów o znanych stężeniach, przy uprzednim pomiarze tła (roztwór soli fizjologicznej z barwnikiem).

Tworzymy roztwory białek w soli fizjologicznej, które po dodaniu odczynnika barwiącego Bio-Rad Protein Assay zmieniają kolor. Zmiana barwy polega na oddziaływaniu głównie z argininą, w mniejszym stopniu z innymi zasadowymi aminokwasami. Absorbancję mierzymy dla długości fali równej 595 nm.

3.      Oznaczenie zawartości albumin i globulin:

Albuminy:

Przeprowadziliśmy dwie serie pomiarów krzywej kalibracyjnej, ale jedną odrzuciłam z powodu gorszej liniowości przebiegu.

Stężenia albumin w poszczególnych próbkach obliczyłam według schematu:

Poniższy wykres przedstawia krzywą kalibracyjną wraz z jej równaniem:

Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,107, więc jej stężenie to 0,00339 [mg/ml].

Globuliny:

W poniższej tabeli zestawiamy wyniki pomiarów spektrofotometrycznych lepiej dopasowanej krzywej dla globulin:

Stężenie liczyłam taką samą metodą jak dla albumin, z tym, że stężenie globulin wynosiło 1,11 [mg/ml]

Krzywa kalibracyjna dla globulin (odrzuciłam drugi i ostatni punkt):

Absorbancja mojej próbki wynosiła 0,191, więc z równania krzywej wynika, iż jej stężenie wynosi 0,00911[mg/ml].

Obie próbki były wielokrotnie rozcieńczone, więc ich prawdziwe stężenie w mleku jest inne, niż powyżej przedstawione. Aby obliczyć prawdziwe stężenie białek musimy uwzględnić:

·         rozcieńczenie przy dodawaniu odczynnika (1000 ml/800ml, czyli 1,25-krotne),

·         rozcieńczenie przed dodaniem odczynnika barwiącego (globuliny 20-krotne, a albuminy 40-krotne),

·         osady globulin i albumin rozcieńczałam w 5 ml roztworu soli fizjologicznej (dzięki tej informacji jestem w stanie obliczyć masę białek w próbce,

·         otrzymana masa białek pochodziła z 3 ml serwatki, więc jestem w stanie policzyć zawartość białek w całej serwatce (25 ml) :

Aby obliczyć zawartość procentową w mleku, muszę znać masę 25 ml mleka. Gęstość mleka to 1,028[g/ml]: