Ćwiczenia_6.pdf

Ćwiczenia 6.

METODY PRZYGOTOWYWANIA TKANEK ZMINERALIZOWANYCH DO

BADAŃ MIKROSKOPOWYCH

Technika szlifów

Technika szlifów pozwala obserwować strukturę zmineralizowanych części tkanek twardych,

takich jak kość czy ząb. W tym celu tkanka poddawana jest procesowi maceracji

polegającemu na rozkładzie części miękkich (niezmineralizowanych) pod wpływem silnych

roztworów zasad (KOH, NaOH) i wypłukaniu ich wodą. Po wypłukaniu pozostają w tkance

wyłącznie składniki najsilniej zmineralizowane. W przypadku kości i szkliwa zębów to

kryształki fosforanów wapniowych (hydroksyapatyty).

Uzyskiwanie szlifów kostnych:

Ze zmacerowanej kości wycina się przy pomocy cienkiej piłki małe płytki około 2mm, które

szlifuje się następnie przy pomocy drobnoziarnistego specjalnego kamienia lub też na

płytkach drobnoziarnistego karborundu. Gdy szlif stanie się prawie przezroczysty (20 m

grubości) wypłukuje się resztki użytego do szlifowania materiału przy pomocy alkoholu. Szlif

można podbarwić np. fioletem goryczki (wypełnia jamki kostne i kanały Haversa). Po

ułożeniu na szkiełku podstawowym szlif zamyka się w balsamie kanadyjskim.

Technika skrawków

Zmineralizowane tkanki można kroić na mikrotomie jedynie pod warunkiem uprzedniego

usunięcia z nich składników mineralnych, czyli po poddaniu ich procesowi demineralizacji

(odwapniania).

Substancje używane do odwapniania to albo roztwory kwasów, albo związków chelatujących

jony wapnia, czyli tworzących z tymi jonami niedysocjujące, rozpuszczalne kompleksy.

Do pierwszej grupy należą roztwory mocnych kwasów:

azotowego (5-10%),

solnego (5-10%),

lub słabszych:

mrówkowego (10%),

octowego (5%),

trójchlorooctowego (2-5%),

pikrynowego (roztwór nasycony)

Mocnych kwasów używa się do szybkiego (do 24 godz.) odwapniania materiału, prowadzi to

jednak do znacznego uszkodzenia tkanek. Lepszy efekt daje dłuższe odwapnianie (zwykle do

14 dni) w słabszych kwasach. Wszystkie kwasy uszkadzają w większym lub mniejszym

stopniu tkanki.

Do drugiej grupy związków chelatujących należy najlepszy z odczynników

demineralizujących - sól sodowa lub potasowa kwasu etylenodwuaminoczterooctowego

(EDTA, wersenian dwusodowy 10%). Substancja ta nie powoduje uszkodzenia tkanki i

zachowuje jej aktywność enzymatyczną, dlatego może być stosowana w immunohistochemii.

Wadą EDTA jest powolne działanie – proces odwapniania może trwać do 8 tygodni.

Mieszaniny odwapniające:

10% kwas mrówkowy + 4% formalina zbuforowana 1:1

Kwas trójchlorooctowy 5 g

Formaldehyd 20 ml

Woda destylowana 100 ml

Utrwalacz Bouina ze względu na zawartość kwasu octowego i pikrynowego dobrze działa

jako odwapniacz.

Materiał odwapnia się zazwyczaj od kilku do kilkunastu dni, w zależności od wielkości tkanki

i stopnia mineralizacji.

Po odwapnieniu tkanki płucze się w wodzie bieżącej lub destylowanej i przetrzymuje w

alkoholu 70%. W przypadku utrwalacza Bouina tkanki przenosi się do 70% alkoholu.

W pracowniach histopatologicznych stosuje się komercyjnie dostępne gotowe mieszaniny

odwapniające:

Decalcifier II - wchodzi w reakcję z jonami wapnia obecnymi w złogach wewnątrz tkanki

czego rezultatem są sole wapniowe zatrzymywane w roztworze.

Osteodec - roztwór dwusodowego EDTA w kwaśnym buforze. Takie rozwiązanie pozwala

przyspieszyć proces odwapniania biopsji i małych wycinków z jednoczesnym zachowaniem

wszystkich struktur komórkowych.

Barwienie szkieletu alizaryną

Długa procedura, może trwać kilka tygodni. Zalety: barwienie in situ, daje wgląd w budowę

anatomiczną organizmu,

Utrwalanie

Materiał utrwala się w 4% formalinie.

Maceracja

Po utrwaleniu materiał poddaje się maceracji w 3% roztworze KOH. Wskazane jest

odbarwienie skóry przez dodanie perhydrolu. Długość macerowania zależy od wielkości

barwionego preparatu: od kilku dni do kilku tygodni.

Barwienie

1% wodny roztwór alizaryny dodany do roztworu macerującego. Barwi się 12-48 godzin aż

do uzyskania rubinowego koloru.

Następnie ponownie się maceruje w KOH 24-48 godzin.

Prześwietlenie

Aby zabarwiony szkielet był widoczny należy prześwietlić preparat, czyli uzyskać jego

przeźroczystość. Uzyskuje się to przez przeprowadzenie preparatu przez szereg roztworów

gliceryny o wzrastającym stężeniu (50%, 75%, 90%). Roztwory gliceryny sporządza się w

3% KOH. Prześwietlony materiał przechowuje się w 100% glicerynie.

PRAKTYKA

Oglądanie preparatów alizarynowych i szlifów kości.

Barwienie Van Gieson

Ira Thompson van Gieson amerykański lekarz patolog wprowadził technikę barwienia

włókien kolagenowych pikrofuksyną , znaną do dziś jako barwienie van Giesona .

Metoda barwienia jest przydatna w diagnostyce marskości wątroby.

pikrofuksyna Van Gieson : nasycony kwas pikrynowy 100 ml

1% fuksyna kwaśna wodna 10 ml

hematoksylina żelazowa Weigerta :

Roztwór A : Hematoksylina 1g

95% etanol 100 ml

Roztwór B :

chlorek żelaza 29% 4 ml

woda destylowana 95 ml

kwas solny 1 ml

Roztwory A i B miesza się w proporcji 1:1.

Wyniki:

jądra-czarne, włókna tkanki łącznej- czerwone, cytoplazma, mięśnie, neuroglej, śluz,

koloid- od żółtej do pomarańczowej.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: