Gen prokariotyczny tworza:
· promotor,
· miejsce rozpoczecia i terminacji transkrypcji,
· miejsce przylaczenia sie rybosomu,
· wlasciwa sekwencja kodujaca ograniczona miejscem rozpoczecia i zokonczenia translacji,
Promotor jest obszarem odpowiadajacym za wiazanie sie polimerazy RNA - enzymu odpowiadajacego za transkrypcje (czyli przepisywanie informacji z DNA na RNA). Sekwencje promotorowe moga byc specyficzne dla roznych polimeraz RNA. Przed promotorem (czyli blizej konca 5') moga znajdowac sie sekwencje odpowiedzialne za wiazanie innych bialek biorocych udzial w transkrypcji (tzw. czynnikow transkrypcyjnych)
Po przylaczeniu sie polimerazy RNA do promotora transkrypcja zaczyna sie od ustalonego miejsca, i jest kontynuowana az do napotkania terminatora. Zwykle terminatorem jest fragmeny DNA, ktory tworzy strukture "szpilki do wlosow".
Pomiedzy miejscem inicjacji transkrypcji a jej terimnatorm, znajduje sie najwazniejszy obszar w obrebie genu - wlasciwa sekwencja kodujaca (tzw. ramka odczytu). Srednia jej dlugosc wynosi ok. 1000 nukleotydow, co odpowiada ponad 300 aminokwasom (zobacz - kod genetyczny). Przed ramka odczytu znajduje sie jeszcze jedna bardzo wazna sekwencja, ktora odpowiada za przylaczanie sie struktury bedacej posrednikiem w tlumaczeniu kolejnych nukleotydow na jezyk aminokwasow (rybosom). Nalezy jednak pamietac, ze przylaczenie sie rybosomu nastepuje dopiero po przepisaniu DNA na mRNA.
Analizujac strukture genu, zarowno prokariotycznego jak i eukariotycznego, nalezy, rowniez zapoznac sie z kolejnymi etapami ekspresji informacji genetycznej, czyli:
· transkrypcji
· potranskrypcyjnej obrobki pre-mRNA
· translacji
Proces transkrypcji u Prokaryota rozpoczyna sie od zwiazania sie polimerazy RNA (glownego enzymu katalizujacego) do odpowiedniej sekwencji na DNA, zwanej promotorem.
Promotory sa podobne we wszystkich genach organizmow prokariotycznych. W ich budowie istotne sa dwie, zwykle szescionukleotydowe sekwencje. Jedna z nich - polozona blizej konca 5', jest pierwsza rozpoznawana przez polimeraze.
Polimeraza RNA jest enzymem skladajacym sie z czesci rdzeniowej, zbudowanej z trzech roznych elementow bialkowych, oraz podjednostki odpowiedzialnej za rozpoznawanie i wiazanie sie do sekwencji promotorowych. Podjednostka ta nazywana zostala czynnikiem sigma. W komorkach prokariotycznych istnieje wiele takich czynnikow. Wykazuja one specyficznosc dla okreslonych promotorow i dzieki tej wlasnosci moga wplywac na regulacje ekspresji genow.
Aby moglo dojsc do rozpoczecia syntezy RNA, nie wystarcza zwiazanie polimerazy RNA z elementami promotorowymi.Konieczne jest rowniez przejscowe rozdzielenie podwojnego lancucha DNA (proces ten nazwano topnieniem).
Wszystkie wyzej opisane procesy, czyli:
· rozpoznanie promotorow przez czynnik sigma,
· przylaczenie polimerazy RNA do elementow promotorowych,
· miejscowe rozdzielenie helisy DNA.
skladaja sie na tzw. inicjacje traskrypcji.
Kolejnym etapem trasnkrypcji jest elongacja. W czasie jego trwania polimeraza RNA przesuwa sie po nici DNA, syntetyzujac RNA. Substratmi w tym procesie sa rybonukleotydy (ATP, GTP, CTP i UTP). Energia zmagazynowana w ich wysokoenergetycznych wiazaniach jest wykorzystywana do wytwarzania wiazan fofodiestrowych w RNA. W trakcjie elongacji powstaje przejsciowa struktura hybrydowa DNA-RNA.
Omawiajac proces elongacji warto dokladniej przeanalizowac jedena czesto umykajacy uwadze prawidlowosc dotyczaca calego procesu transkrypcji.
· Czasteczka DNA sklada sie z dwoch pojedynczych nici. Jedna z nich jest wlasciwa nicia kodujaca bialka (tzw. nic sensowna), natomiast droga, komplementarna do niej, to nic niekodujaca - nonsensowna. Taka struktura DNA pozwala nie tylko na latwe kopiowanie DNA (patrz replikacja), jak i na przepisywanie informacji na RNA. Podczas transkrypcji powstajaca nic RNA jest komplementarna tylko do jednej nici DNA - nonsensownej (inaczej mowiac nic nonsensowna jest matryca). Dzieki temu nowo powstale RNA jest, co do kolejnosci nukleotydow, takie same jak nic kodujaca (nie zapominajac o tym, ze zamiast tyminy, w RNA wystepuje uracyl).
Transkrypcja konczy sie w scisle okreslonym miejscu DNA zwanym terminatorem. Tu zachodzi oddysocjowanie polimerazy RNA od DNA. Istnieja dwa mechanizmy terminacji transkrypcji.
· W jednym z nich polimeraza RNA odlacza sie od lancucha DNA po napotkaniu odpowiedniej sekwencji. Sekwencja ta jest bagata w zasady C i G, co umozliwia jej tworzenie struktury "szpilki do wlosow" na nici RNA.
· Drugi mechanizm jest zalezny od pewnego bialka zwanego czynnikiem uwalniajacym. Bialko to wiaze sie z okreslona sekwencja na DNA uniemozliwiajac tym samym dalsza elongacje.
Koniecznosc posttranskrypcyjnej obrobki materialu zawierajacego informacje genetyczna spowodowane jest dwoma cechami organizmow eukariotycznych:
· Wiekszosc genow Eukaryota ma nieciagly chrakter, znaczy to, ze skladaja sie one z naprzemiennie wystepujacych obszarow kodujacych - eksonow oraz niekodujacych intronow. Procesowi transkrypcji ulegaja zarowno introny, jak i eksony, ale w sklad funkcjonalnego mRNA nie moga wchodzic elementy niekodujace. Musi zatem istniec mechanizm umozliwiajacy ich wycinanie.
· Ponadto, w przeciwienstwie do Prokaryota procesy transkrypcji i translacji sa rozdzielone w czasie i przestrzeni. Matrycowe RNA powstaje na terenie kompartmentu jadrowego, natomiast translacja zachodzi w cytoplazmie. W zwiazku z tym musza istniec struktury umozliwiajace transport mRNA do cytoplazmy.
Produktem transkrypcji genu jest zawierajaca introny i niezdolna do eksportu z jadra czasteczka prekursorowego mRNA (pre-mRNA). Taki pierwotny transkrypt musi ulec trzem procesom, aby stac sie matryca do translacji.
· Na koncu 5' dosyntetyzowana musi byc struktura odpowiedzialna za przylaczenie sie rybosomu, tzw. czapeczka (od ang. cap proces ten nazwano capping). Czapeczka jest zbudowana z trzech reszt fosforanowych oraz zmetylowanej guaniny.
· Koniec 3' formowany jest przez specjalny kompleks bialkowy. W sklad tego kompleksu wchodzi poliA polimeraza, ktorej zadaniem jest dosyntetyzowanie "ogona" zlozonego z samych nukleotydow adenylowych, tzw. poliA ogon. Taka poliadenylacja jest niezbedna do przetransportowania mRNA do cytoplazmy, jednoczesnie chroniac je przed degradacja. Poliadenylacja jest uwatunkowana wystepowaniem specyficznych sekwencji na 3' koncu pre-mRNA.
· Najbardziej skomplikowanym procesem podczas "dojrzewania" mRNA jest wycinanie intronow, czyli tzw. splicing. W wyciananiu intronow bierze udzial specjalny kompleks bialkowy zwany splicesomem. Proces ten polega na odpowiednim wypetleniu intronow z udzialem endonukelaz i polaczeniu eksonow w jedna nic. Laczonie eksonow katalizowane jest ligazami. Istnieje kilka mechanizmow usuwania intronow, m.in. samowycinanie (ang. self-splicing). W przypadku samowycinania role katalizatorow moga pelnic czasteczki mRNA, zdolne do przyjmowania odpowiednich konformacji.
Translacja, czyli biosynteza bialek jest ostatnim etapem ekspresji informacji genetycznej. Po przepisaniu informacji z nukleotydowej sekwencji DNA na RNA (mRNA), translacja pozwala na przetlumaczenie szyfru nukleotydowego na jezyk aminokwasow w bialku.
System translacji dziala podobnie zarowno u organizmow prokariotycznych, jak i u eukariotycznych, z ta roznica, ze u Eucariota nastepuje przestrzenne oddzielenie transkrypcji od translacji (translacja odbywa sie na terenie cytoplazmy co wiaze sie z koniecznosca transportu mRNA z przedzialu jadrowego).
Przed omowieniem samego procesu translacji, nalezy wspomniec o strukturach niezbednych do jego przeprowadzenia, sa nimi:
· rybosomy,
· transferowe RNA (tRNA).
Obok tych struktur, w procesie biosyntezy bialka biora udzial rowniez: matrycowe RNA (mRNA) oraz wysokoenergetyczne zwiazki, ktorych zadaniem jest dostarczenie energii (najprawdopodobniej sa nimi czasteczki GTP).
W procesie translacji poszczegolne skladniki musza znalesc sie w scisle okreslonym polozeniu w stosunku do siebie, zatem czasteczki bioroce w nim udzial musza zostac uporzadkowane przestrzennie. Taka porzadkujaca funkcje pelnia rybosomy. Latwosc dysocjacji i asocjacji obu podjednostek rybosomalnych umozliwia skutecznie wiazanie sie tych organelli z mRNA oraz aminoactlo-tRNA.
Rozpoznanie odpowiedniego tripletu nukleotydowego na mRNA odbywa sie dzieki dzieki uniwersalnej dla oddzialywan miedzy kwasami nukleinowymi regule komplementarnosci (antykodon z tRNA musi sie laczyc z odpowiednim kodonem polozonym na mRNA).
Po zwiazaniu sie mRNA pomiedzy dwie podjednostki, w miejsca A i P rybosomu dolaczane sa odpowiednie aminoacylo-tRNA. Pierwszym, dolaczanym do kodonu inicjatorowego (AUG), jest zwykle aminoacylo-tRNA, zwiazane z N-formylomietionina. (tzw. f-Met-tRNA).
Dalej proces translacji zachodzi w nastepujacych po sobie cyklach. Poszczegolne fazy jednego z takich cykli przedstawiaja sie nastepujaco:
· W miejscu P rybosomu znajduje sie tRNA z dolaczonym f-Met-tRNA lub tRNA z fragmentem lancucha polipeptydowego, jesli jest to jeden z dalszych cykli. Oczywiscie wymienione poprzednio tRNA musza miec antykodony komplementarne do kodonow na mRNA.
· Do wolnego miejsca A dolacza sie nowy aminoacylo-tRNA z antykodonem odpowiadajacym trojce, znajdujacej sie wlasnie w tym miejscu.
· Nastepnym etapem jest wytworzenie wiazania peptydowego pomiedzy aminokwasem znajdujacym w miejscu A a fragmentem lancucha polipeptydowego. Dzieki temu lancuch wydluza sie o jeden aminokwas i przenoszony jest w miejsce A rybosomu. Tworzenie lancucha polipeptydowego ma charakter enzymatyczny, katalizatorem jest w niej fragment RNA z duzej podjednostki.
· W kolejnej fazie zdeacylowany tRNA z jest odrzucany z miejsca P, a na jego miejsce przesuwa sie tRNA z dolaczonym fragmentem polipeptydu. Towarzyszy temu przemieszczenie sie mRNA (translokacja), przy uzyciu energii z wysokoenergetycznych wiazan GTP. W ten sposob, ze naprzeciw wolnego juz miejsca A pojawia sie kolejny kodon, odpowiadajacy nowemu aminokwasowi.
Proces translacji konczy sie, gdy w miejscu A pojawi sie jeden z kodonow terminacyjnych (UGA - opal, UAA - ochre lub UAG - amber). Zadnemu z trzech kodonow stop nie odpowiada aminokwas. W rezultacie dochodzi do dolaczenia czynnikow terminacyjnych (RF), ktore powoduja uwalnianie polipeptydowego produktu oraz dysocjacje calego kompleksu rybosomowego.
Powstaly polipeptyd musi ulec pewnym modyfikacjom chemicznym m.in. proteolitycznemu obcieciu N-formylometioniny, a nastepnie przyjac odpowiednia konformacje, ktora pozwoli na pelnienie odpowiedniej funkcji.
Wszystkie komorki w wielokomorkowym organizmie eukariotycznym maja DNA o jednakowym zestawie genow. Mimo tego nie wszystkie komorki wygladaja tak samo. Ta prosta obserwacja swiadczy o tym, ze ekspresja materialu genetycznego musi podlegac regulacji.
Organizmy jednokomorkowe (bakterie i niektore proste Eucariota), z kolei musza miec sprawne mechanizmy pozwalajace na dostosowanie sie do zmiennych warunkow srodowiska, gdyz jako pojedyncze komorki sa w duzym stopniu zalezne od niego. Bakterie musza byc przygotowane na szybka zmiana "diety" tj. niezbednych do zycia substratow pokarmowych.
Odmiennosc mechanizmow regulacyjnych u obu wymieniomych grup jest na tyle duza, zasluguja one na oddzielne omowienie
Ekspresja materialu genetycznego u Eucariota podlaga regulacji, podobnie jak u organizmow prokariotycznych. Ale ze wzgledu na wieksza zlozonosc struktur, eukariotyczne mechanizmy regulacyjne sa bardziej skomplikowane. Regulacja ekspresji informacji dziedzicznej organizmow eukariotycznych moze byc realizowana na wiele sposobow. Poszczegolne etepy wyrazania sie genow odbywaja sie w roznych przedzialach komorkowych, co daje dodatkowe mozliwosci regulacyjne.
Olbrzymia wiekszosc genow u Eucariota jest regulowana na poziomie transkrypcji (porownaj transkrypcja), ale istnieja tez inne poziomy, gdzie modyfikowane moze byc dzialanie genow. Zatem regulacja moze sie odbywac przez:
· Wybor jednego z kilku miejsc terminacji transkrypcji. Organizmy eukariotyczne maja specjalne sekwencje na 3' koncu pierwotnego transkryptu, po rozpoznaniu ktorych nastepuje poliadenylacja (porownaj posttranskrypcyjne etapy ekspresji genow eukariotycznych). Jednakze niektore geny maja kilka miejsc dodawania lancucha poliA, wybor jednego z nich moze determinowac rodzaj powstajacego transkryptu. Z taka sytuacja mamy do czynienia w genach kodujacych ciezkie lancuchy przeciwcial.
· Rozne wycinanie intronow z gotowego transkryptu, czyli alternatywny splicing.W wyniku laczenia ze soba roznych egzonow moze powstac wiecej niz jeden rodzaj mRNA, niestety mechanizm tego zjawiska nie jest do konca poznany.
· Zmiany w sekwencji transkryptu, tzw. redagowanie. Wkryto, ze transkrypty niektorych genow nie sa w pelni zgodne z odpowiednimi genami. Moga zawierac punktowe mutacje lub calkiem rozlegle addycje i delecje. Zmiany te powstaja powstaja po transkrypcji i sa najprawdopodobiniej realizowane przez zlozony kompleks enzymatyczny, w ktorego sklad wchodza: endonukleaza, 3'-egzonukleaza, aminotransferaza i ligaza.
· Regulacje stabilnosci mRNA Od tego jak dlugo mRNA moze sie utrzymac w cytoplazmie (byc matryca) zalezy jak dlugo utrzyma sie efekt dzialania danego genu. Zatem czas poltrwania mRNA wplywa bezposrednio na czas ekspresji genu.
· Regulacje transportu mRNA z jadra do cytoplazmyIstnieja mechanizmy, pozwalajace na zatrzymywanie w jadrze tych mRNA, ktore w danym momencie nie powinny ulegac ekspresji. U niektorych Eucariota warunkiem eksportu transkryptu z jadra jest prawidlowe uformowanie konca 3'.
· Regulacje stabilnosci bialek.Dzialanie danego produktu bialkowego moze byc regulowane poprzez jego degradacje lub jej brak. Degradacja bialek jest procesem aktywnym, w ktorym bierze udzial male bialko zwane ubikwityna. Enzymatyczne przylaczenie ubikwityny do bialka powoduje jego degradacje (proces ten wymaga energii ATP). Ubikwitynizacja jest rownieza istotna dla poprawnego funkcjonowania komorek, dzieki niej degradowane moga byc nieprawidlowe bialka.
W ostatnich latach stworzono wiele nowych metod zwiazanych z modyfikacja DNA in vitro. I wlasnie dzialania, ktore maja na celu rekombinacje kwasow nukleninowych (w sztucznych warunkach) pochodzacych z roznych zrodel, a nastepnie wprowadzanie ich do odpowiednio przygotowanych zywych komorek, w celu uzyskania replikacji lub ekspresji zawartych tam genow, nazwano inzynieria genetyczna.
Rozwoj technik inzynierii genetycznej pozwolil na ich technologiczne wykorzystanie. Zintegrowanie zastosowan wiedzy i technik z zakresu biologii molekularnej, biochemii, mikrobiologii oraz nauk inzynieryjnych w celu technologicznego wykorzystania drobnoustrojow, kultur tkankowych lub elementow komorek (np.enzymow) doprowadzilo do powstania biotechnologii. Obecnie wytwarzane sa tzw. uzyteczne organizmy oraz substancje pochodzace z organizmow dzieki mozliwosci kontrolowanej modyfikacji genotypow i tworzeniu nowych kombinacji genowych.
Wlasnie techniki inzynierii genetycznej sa najbardziej perspektywiczne jezeli chodzi o zastosowanie biotechnologiczne. Bez nich niemozliwe byloby szereg osiagniec biotechnologii w medycenie, przemysle farmaceutycznym, czy hodowlii. Jednakze mimo niebagatelnego wkladu jaki biotechnologia wniosla w zycie codzienne, caly czas budzi ona sprzeciwy, obawy i emocje. Nadal uznaje sie trudne do przewidzenia wprowadzenie organizmow ze zrekombinowanymi kwasami nukleinowymi do srodowiska naturalnego. Nadal, glownie w srodowiskach pozanaukowych, biotechnologia spotyka sie ze sporymi sprzeciwami. Prowadzone sa jednak intensywne badania bezpieczenstwa pracy w przemysle stosujacym zrekombinowane organizmy.
Czasteczki tRNA stanowia lacznik w procesie przekazywania informacji zwartej w mRNA na jezyk aminokwasow. Ich zadaniem jest dostarczenie odpowiednich aminokwasow do stynezy bialka. Musza zatem miec miejsce odpowiedzialne za przylaczenie sie aminokwasu oraz czesc rozszyfrowujaca informacje niesiona przez mRNA (patrz translacja).
Czasteczki tRNA maja dlugosc od 74 do 95 nukleotydow, Wewnetrzna komplementarnosc zasad pozwala na tworzenie charakterystycznej struktury, podobnej do liscia koniczyny. Lecz nie jest to idealny "lisc koniczyny", gdyz obok czterech duzych ramion wystepuje dodatkowo mniejsze, zwane ramieniem dodatkowym (to male ramie jest czesto podstawa do klasyfikacji tRNA).
Jedno z czterech (a wlasciwie pieciu) ramion w tRNA, zwane ramieniem akceptorowym, stanowi miejsce przylaczania sie aminokwasow. Laczenie odpowiednich aminokwasow ze swoistymi tRNA ma charakter enzymatyczny i katalizowane jest przez odpowiednie enzymy zwane aminoacylo-tRNA syntetazami - reakcje te wymagaja energii z ATP. Produkt otrzymany po dolaczeniu aminokwasu do tRNA nazywany jest aminoacylo-tRNA. W kazdej komorce istnieje przynajmniej 20 rodzajow czasteczek tRNA, poniewaz kazdemu aminokwasowi musi odpowiadac co najmniej jedno tRNA. Zwykle liczba tRNA, odpowiadajaca danemu aminokwasowi jest wieksza od jednego (patrz kod genetyczny).
Na przeciw ramienia akceptorowego lezy ramie antykodonowe . Na jego koncu znajduje sie trojka nukleotydow, ktora rozpoznaje komplementarna trojke na nici mRNA podczas translacji (patrz translacja). Ten nukleotydowy triplet na czasteczce tRNA nazwany zostal antykodonem.
Wiadomo, ze w sklad jednoniciowego lancucha tRNA wchodzi wiele zmodyfikowanych zasad azotowych. Modyfikacje te polegaja na dolaczeniu roznych grup funkcyjnych i dokonywane sa w procesie dojrzewania (obrobki posttranskrypcyjnej).
ephedra