ZALEŻNA OD UBIKWITYNY DEGRADACJA BIAŁEK.pdf

Tom 54 2005

Numer 2–3 (267–268)

Strony 133–148

B ARBARA G RZELAKOWSKA -S ZTABERT

Zakład Biochemii Komórki

Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, PAN

ul. Pasteura 3, 02-093 Warszawa

e-mail b.grzelakowska@nencki.gov.pl

ZALEŻNA OD UBIKWITYNY DEGRADACJA BIAŁEK

NAGRODA NOBLA Z CHEMII W 2004 ROKU*

Metabolizm komórki ściśle zależy od po-

ziomu i aktywności wielu różnych białek,

które podlegają regulacji na poziomie trans-

krypcji, translacji, modyfikacji potranslacyj-

nych, a także zależą w bardzo dużym stopniu

od efektywności ich proteolizy nieodwracal-

nie degradującej białka. W komórkach eu-

kariotycznych występują dwa podstawowe

systemy degradacyjne - lizosomalny i pozali-

zosomalny. W systemie lizosomalnym degra-

dowane są przede wszystkim białka zewną-

trzkomórkowe dostające się do komórek na

przykład podczas endocytozy, czy też białka

wewnątrzkomórkowe, jeśli komórka poddana

jest silnemu stresowi, np. podczas głodzenia.

Natomiast pozalizosomalny układ proteoli-

tyczny, to zależny od ATP szlak ubikwityna/

proteasom, którego badania rozpoczęły się

w końcu lat 70. XX w. W układzie tym, jak

obecnie wiadomo, są degradowane, oprócz

białek strukturalnych i konstytutywnych, tak

ważne dla prawidłowego funkcjonowania ko-

mórek enzymy regulujące szlaki biosyntetycz-

ne, białka regulujące przebieg cyklu komór-

kowego, wiele czynników transkrypcyjnych,

białek kodowanych przez onkogeny i geny

supresorowe czy też białek biorących udział

w odpowiedzi immunologicznej. Szczególnie

duże zainteresowanie pozalizosomalnym ukła-

dem proteolitycznym rozpoczęło się w poło-

wie lat 80. minionego wieku, a jego kulmina-

cją jest przyznanie w 2004 r. jego

tion” , jak głosi werdykt Królewskiej Szwedz-

kiej Akademii Nauk, zostali:

Irwin Rose urodzony w Nowym Yorku

(1926), biochemik (PhD 1952), ponad 30 lat

pracujący w Fox Case Cancer Center w Fila-

delfii, od 1995 r. kontynuujący pracę nauko-

wą na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine,

członek National Academy of Sciences USA.

Avram Hershko , urodzony w Karcag,

Węgry (1937), od 1950 r. obywatel Izraela,

doktor medycyny (MD 1965) i biochemii

(PhD 1969), od 1972 r. profesor w Instytu-

cie Badawczym Nauk Medycznych im. Ro-

dziny Rappaportów w Izraelskim Instytucie

Technologii (Technion) w Hajfie, laureat na-

grody Weizmana, nagrody Izraela, razem z A.

Varshavskim i A. Ciechanoverem nagrody im.

Alberta Laskera (2000), członek National Aca-

demy of Sciences USA.

Aaron Ciechanover , urodzony w Hajfie

(1947), obywatel Izraela, doktor medycyny

(MD 1981), od początku lat 80. minionego

wieku profesor w Zakładzie Biochemii i dy-

rektor Instytutu Badawczego Nauk Medycz-

nych im. Rodziny Rappaportów w Izraelskim

Instytucie Technologii w Hajfie, laureat na-

grody Izraela oraz, wraz z A. Hershko i A.

Varshavskim, nagrody im. A. Laskera (2000).

Zasługą powyższych badaczy jest odkry-

cie i opisanie podstaw działania zależnej od

ubikwityny (i ATP) proteolizy białek, pro-

cesu precyzyjnie regulowanego i specyficz-

nego w stosunku do białkowego substratu,

jego lokalizacji komórkowej i momentu,

w którym ma nastąpić jego degradacja. Za-

*patrz także art.: B. G ZELAKOWSKA -S ZTABERT , Nagroda Nobla z chemii za 2004 rok — docenienie kontrolowanej,

zależnej od ubikwityny, proteolitycznej degradacji białek . Post. Biol. Kom. 32, 3–12, 2005.

odkryw-

com nagrody Nobla z dziedziny chemii.

Laureatami nagrody Nobla „ for the disco-

very of ubiquitin-mediated protein degrada-

134

B ARBARA G RZELAKOWSKA -S ZTABERT

interesowania badawcze każdego z laure-

atów odzwierciedlają tytuły ich wykładów

noblowskich:

Irwin Rose „How ubiquitin chains are

made and unmade” (Jak powstaje i rozpada

się łańcuch poliubikwitylowy),

Avram Hershko „The ubiquitin system

for protein degradation and its roles in the

control of cell division” (Udział ubikwityny

w degradacji białek i jej rola w kontroli po-

działu komórki),

Aaron Ciechanover „Intracellular prote-

olysis — from a vague idea into the patient

bed” (Wewnątrzkomórkowa proteoliza — od

idei do łóżka pacjenta).

Obecnie I. Rose pracuje naukowo

w dziedzinie nie dotyczącej proteolizy bia-

łek. A. Hershko kontynuuje badania degra-

dacji takich istotnych regulatorów cyklu

komórkowego jak cyklina B i inhibitor

cyklu białko p27 oraz interesuje się me-

chanizmem działania enzymów przepro-

wadzających ubikwitylację białek. Badania

A. Ciechanovera dotyczą przede wszystkim

regulacji stabilności przez układ ubikwity-

na/proteasom czynników transkrypcyjnych

p53, c-Myc, NF κ B i MyoD oraz powiązań

pomiędzy proteolizą białek w omawianym

układzie a apoptozą komórek.

UBIKWITYLACJA BIAŁEK — HISTORIA I TERAŹNIEJSZOŚĆ

Początki badań tego problemu sięgają do-

świadczeń A. Hershko z końca lat 70. XX w.

i dotyczących degradacji enzymu — amino-

transferazy tyrozynowej oraz udziału w tym

procesie ATP. Konsekwencja i determinacja

A. Hershko w wyjaśnianiu, jak się wówczas

wydawało, paradoksu — konieczności udzia-

łu energii w wewnątrzkomórkowej degra-

dacji białek — doprowadziła do jego ścisłej

współpracy z A. Rose, a następnie z A. Cie-

chanoverem. Pracując wspólnie w laborato-

rium kierowanym przez Rose nad proteolizą

różnych białkowych substratów zachodzącą

w bezkomórkowych lizatach z retikulocytów

królika, badacze Ci zaproponowali w 1980

r. model czteroetapowej degradacji białek

(H ERSHKO i współaut. 1980). Etap I to dołą-

czenie do białka przeznaczonego do degrada-

cji niewielkiego globularnego białka nazwa-

nego APF-1 (ang. ATP-dependent proteolytic

factor) przez enzym — syntetazę, w procesie

wymagającym ATP. Etap II to korekcja „błęd-

nie” oznakowanego substratu poprzez usu-

nięcie APF-1 przez enzym izopeptydazę. Etap

III polegać miał na degradacji białka ozna-

kowanego APF-1 pod działaniem endopepty-

dazy (wielo-katalitycznej i wielo-funkcyjnej

proteazy) do peptydów połączonych z APF.

W ostatnim etapie IV, dochodziłoby do od-

szczepienia na drodze enzymatycznej APF-1

i dalszego rozkładu peptydów.

W latach 1981–1983 Rose, Hershko i Cie-

chanover prowadzili intensywne badania

zmierzające do udowodnienia słuszności za-

proponowanego wcześniej modelu, który, co

prawda w postaci mocno rozbudowanej, obo-

wiązuje do dzisiaj. Przede wszystkim wykaza-

li, że białko APF-1 jest identyczne z odkrytą

w 1975 r. ubikwityną, niewielkim, zbudowa-

nym z 76 aminokwasów białkiem globular-

nym. Stosując szereg metod biochemicznych,

w tym frakcjonowanie lizatów białkowych

i oznakowaną izotopem ubikwitynę, wyklu-

czyli jej działanie jako aktywatora syntetazy,

a opracowaną w laboratorium metodą immu-

nochemiczną pokazali dołączanie ubikwityny

do białkowego substratu (H ERSHKO i współ-

aut. 2000). Obecnie wiadomo, że ubikwityna

jest jednym z najbardziej konserwatywnych

białek komórkowych, które występuje w for-

mie wolnej lub związanej we wszystkich

organizmach eukariotycznych (P IOTROWSKA

1993). Centrum aktywne ubikwityny stano-

wią reszty Leu-Arg-Gly-Gly obecne na karbok-

sylowym końcu łańcucha. W procesie kowa-

lencyjnego dołączenia ubikwityny do białka

mającego ulec degradacji C-końcowa glicyna

ubikwityny łączy się wiązaniem izopeptydo-

wym z grupą ε -aminową lizyny koniugowa-

nego białka, możliwe jest również enzyma-

tyczne przenoszenie jednej cząsteczki wolnej

ubikwityny na drugą. W cząsteczce ubikwity-

ny występują cztery reszty lizyny, na których

mogą formować się łańcuchy poliubikwitylo-

we. Obecnie wiadomo, że tylko utworzenie

łańcucha w połączeniu z lizyną w pozycji 48

ubikwityny skierowuje białko do degradacji,

zaś monoubikwitylacja białka lub tworzenie

łańcuchów poliubikwitylowych poprzez li-

zyny obecne w innych miejscach cząsteczki

ubikwityny ma przede wszystkim znaczenie

regulacyjne (W EISSMAN 2001).

Nagroda Nobla z chemii w 2004 roku

135

W etapie I pierwotnego modelu, katalizo-

wanym przez syntetazę, działają, jak to udo-

wodnili Nobliści, nie jeden, a aż trzy enzymy,

których sekwencyjne działanie doprowadza

do ubikwitylacji białka (Ryc. 1). Są to enzym

aktywujący ubikwitynę (E1), enzym koniugu-

jący i przenoszący zaktywowaną ubikwitynę

(E2) oraz enzym zwany ligazą ubikwitylową

(E3), który bierze udział w rozpoznawaniu

substratu mającego ulec degradacji i dołącza-

niu do niego ubikwityny. Do dzisiaj poznano

zaledwie kilka enzymów E1, około dwudzie-

stu enzymów E2 i kilka klas ligaz ubikwi-

tylowych, do których zalicza się już blisko

1000 białek. Należy podkreślić, że w etapie

I tylko reakcja katalizowana przez E1, w któ-

rym tworzy się wysokoenergetyczne wiąza-

nie pomiędzy glicyną na C-końcu ubikwity-

ny a cysteiną obecną w centrum aktywnym

E1, wymaga energii pochodzącej z hydrolizy

ATP do AMP i pirofosforanu. Kolejny etap

to przeniesienie zaktywowanej w powyższy

sposób ubikwityny na enzym E2, z którego

następnie, bezpośrednio lub najczęściej przy

udziale ligaz ubikwitylowych E3, cząsteczka

ubikwityny zostaje przeniesiona na właściwy

białkowy substrat, a kilkukrotne powtórzenie

tej kaskady enzymatycznej prowadzi do utwo-

rzenia łańcucha zbudowanego z co najmniej

czterech reszt ubikwityny, rozpoznawanego

przez kompleks proteasomu. Deubikwitylację

substratu, także w przypadku jego błędnego

oznakowania (etap II) przeprowadzają zaś,

jak opisano poniżej, enzymy deubikwitylują-

ce należące do coraz bardziej powiększającej

się rodziny hydrolaz i izopeptydaz (C HUNG

i B AEK 1999, W ING 2003, G UTERMAN i G LICK -

MAN 2004).

Rozszyfrowano już obecnie endopeptyda-

zy degradujące białka oznakowane ubikwity-

ną (etap III). Proces ten zachodzi w prote-

asomie 26S, kompleksie białkowym złożonym

z wielu podjednostek, charakteryzującym się

szerokim spektrum aktywności proteolitycz-

nej. Zbudowany jest z dwóch podstawowych

subkompleksów: cylindrycznego rdzenia

20S o aktywności proteolitycznej (podjed-

nostki α i β ) oraz dwóch podjednostek re-

gulatorowych 19S (V OGES i współaut. 1999,

Z WICKL i współaut. 2001, F ÖRSTER i H ILL 2003,

P ICKART i C OHEN 2004). Przed dostaniem się

do wnętrza proteasomu 26S, ale już po roz-

poznaniu przez określone białka tworzące

podjednostkę 19S bądź inne białka współ-

działające (ang. shuttle proteins) (H ARTMAN -

-P ETERSEN i G ORDON 2004, M ADURA 2004, V ER -

MA i współaut. 2004a), enzymy deubikwitylu-

jące odszczepiają łańcuch poliubikwitylowy

od białkowego substratu. Dzięki temu staje

się możliwe jego rozfałdowanie (przy udzia-

le ATP-az podjednostki 19S) i proteolityczna

degradacja w proteasomie do krótkich pep-

tydów i aminokwasów (V ERMA i współaut.

2002). Odłączony łańcuch ubikwitylowy jest

następnie degradowany, a uwolnione czą-

steczki ubikwityny ponownie wprowadzone

do obiegu.

Trzeba jednak zauważyć, że w proteaso-

mie 26S mogą także niekiedy być degrado-

wane białka nieoznakowane uprzednio ubi-

kwityną. Klasycznym przykładem jest enzym

— dekarboksylaza ornitynowa, kluczowy en-

zym w biosyntezie polikationów komórko-

wych, poliamin (M ANTEUFFEL -C YMBOROWSKA

1996), także w pewnych warunkach białko

p21, jeden z inhibitorów cyklu komórkowe-

go (T OUITOU i współaut. 2001, B ORNSTEIN

i współaut. 2003), a także prawdopodobnie

i inne białka. Tak w uproszczonej postaci

przedstawia się schemat ubikwitylacji bia-

łek przedstawiany od szeregu lat w licznych

opracowaniach przeglądowych (np. C IECHA -

NOVER i współaut. 2000, W EISSMAN 2001, P IC -

KART 2001, W ILKINSON 2004), także w pol-

skich czasopismach biologicznych (P IOTROW -

SKA 1993; W ÓJCIK 1995; G RZELAKOWSKA -S ZTA -

BERT 2002a, b).

Klasyczna, najwcześniej poznana rola ubi-

kwitylacji polega na miejscowo- i czasowo-

-specyficznym oznakowywaniu białek prze-

znaczonych do degradacji. Należy sobie jed-

nak zdawać sprawę, że ubikwitylacja białka

nie zawsze musi przesądzać o jego degrada-

cji. Mono-lub multiubikwitylacja (bez two-

rzenia łańcucha) białek, a także tworzenie

łańcuchów na lizynie innej niż w pozycji 48,

może być sygnałem do endocytozy białek,

ich transportu do lizosomów lub wakuoli,

może regulować przemieszczanie się białek

pomiędzy jądrem a cytoplazmą, jak również

regulować działanie wielu białek uczestniczą-

cych w różnych procesach metabolicznych

(H AGLUND i współaut. 2003, S CHNELL i H ICKE

2003, S HCHERBIK i H AINES 2004). Omówienie

tych zagadnień przekracza ramy tego opraco-

wania, już jednak ich wyliczenie wskazuje, że

proces ubikwitylacji może dorównywać pod

względem znaczenia procesowi fosforylacji.

Ubikwitylacja jest bowiem, podobnie jak fos-

forylacja, procesem szybkim, do pewnego

momentu odwracalnym, podlega niezmiernie

precyzyjnej regulacji i dotyczy bardzo wielu

białek biorących udział we wszystkich prak-

tycznie procesach istotnych dla prawidłowe-

136

B ARBARA G RZELAKOWSKA -S ZTABERT

go funkcjonowania komórek. Zdaniem wielu

biologów ubikwitynę można zatem traktować

jako jeden z podstawowych regulatorów me-

tabolizmu komórkowego (F INLEY i współaut.

2004). Należy dodać, że w komórkach ziden-

tyfikowano już także wiele białek pokrew-

nych ubikwitynie, które również biorą udział

w wielu procesach regulacyjnych, a ich dołą-

czanie do białek jest równie złożone jak do-

łączanie ubikwityny (S CHWARTZ i H OCHSTRAS -

SER 2003).

Jak już wspomniano, ostatni etap ubikwi-

tylacji białek — rozpoznanie białka przezna-

czonego do degradacji i zbudowanie na nim

łańcucha poliubikwitylowego — odbywa się

przy udziale ligaz ubikwitylowych, które sta-

nowią najliczniejszą grupę spośród enzymów

uczestniczących w ubikwitylacji białek. W dal-

szej części tego opracowania skoncentruję

się na krótkim omówieniu budowy i regula-

cji działania ligaz ubikwitylowych, biorących

udział w regulacji cyklu komórkowego. Moją

arbitralną decyzję o przedstawieniu tej wła-

śnie grupy enzymów uczestniczących w ubi-

kwitylacji usprawiedliwia fakt, że stosunko-

wo najwcześniej poznano ich podstawową

budowę i degradowane substraty, którymi są

przede wszystkim białka regulatorowe cyklu

komórkowego (V EW 2001, G RZELAKOWSKA -

-S ZTABERT 2002a), a w badaniach mechani-

zmów ich degradacji nadal bardzo aktywnie

uczestniczy Noblista A. Hershko. Złożoność

mechanizmów prowadzących do degradacji

regulatorów cyklu omówię na przykładach

degradacji kilku białek: białka p27 — inhibi-

tora kinaz cyklino-zależnych (Cdk), fosfatazy

Cdc25 — enzymu decydującego o aktywności

wszystkich kinaz cyklino-zależnych (za opi-

sanie i udokumentowanie udziału kinaz Cdk

w regulacji cyklu komórkowego L. Hartwell,

P. Nurse i T. Hunt otrzymali nagrodę Nobla

w 2001 r.) oraz sekuryny — białka decydu-

jącego o kohezji chromatyd. Wskażę także

na konsekwencje zaburzeń funkcjonowania

układu ubikwityna/proteasom w patogenezie

wielu schorzeń.

LIGAZY UBIKWITYLOWE — BUDOWA, REGULACJA DZIAŁANIA, SUBSTRATY

BUDOWA LIGAZ UBIKWITYLOWYCH

Ligazy ubikwitylowe są bądź wielopo-

djednostkowymi kompleksami białkowymi,

w których określone podjednostki biorą

udział w rozpoznaniu substratu i dołącza-

niu do niego łańcucha poliubikwitylowego

(dzięki interakcji z enzymem E2) bądź też są

pojedynczymi polipeptydami, w których spe-

cyficzne fragmenty cząsteczki pełnią tę funk-

cję. Wyróżnia się obecnie dwie podstawowe

klasy tych enzymów — ligazy z domeną RING

finger (ang. really interesting new gene), ka-

talizujące bezpośrednie przeniesienie na sub-

strat zaktywowanej i powiązanej z enzymem

E2 ubikwityny oraz ligazy z domeną HECT

(ang. homologous to the E6-AP C-terminus),

w których przed ostatecznym dołączeniem

ubikwityny do właściwego substratu docho-

dzi do przeniesienia zaktywowanej ubikwity-

ny z enzymu E2 na ligazę ubikwitylową E3.

W proteolizie regulatorów cyklu komórko-

wego biorą udział przede wszystkim ligazy

E3 z domeną RING finger (Ryc. 2). Są nimi

wielopodjednostkowe ligazy SCF i APC oraz

monomeryczna ligaza CHFR, których budo-

wę i działanie ostatnio omówiono na łamach

polskich czasopism (G RZELAKOWSKA -S ZTABERT

2002a, 2004). Dlatego teraz przypomnę tyl-

ko podstawowe informacje o tych enzymach,

a szerzej omówię poznane ostatnio mechani-

zmy regulacji ich działania.

Ligazy typu SCF (ang. Skp1-cullin-F-box-

-ROC1) zbudowane są z co najmniej 4 pod-

jednostek (Ryc. 2A). Największą podjednost-

ką jest jedno z białek z rodziny kullin (Cul

1–7), tworzące pomost, na którym dochodzi

do współdziałania z innymi podjednostkami

kompleksu. Końcowa globularna domena

kulliny wiąże się z podjednostką zawierającą

domenę RING finger, białkiem Rbx1/ROC1

(ang. regulator of cullin), o strukturze zbli-

żonej do struktury palca cynkowego, zaan-

gażowanym w rekrutację enzymu E2 skon-

jugowanego z ubikwityną, i, jak się obecnie

przypuszcza, w hydrolizę wysokoenergetycz-

nego wiązania tioestrowego pomiędzy E2

a ubikwityną. N-końcowy fragment kulliny 1,

a także kulliny 7, wiąże podjednostkę Skp1

(ang. S-phase kinase associated protein 1),

stanowiącą łącznik pomiędzy kulliną a białka-

mi Fbp (ang. F-box proteins). W przypadku

ligaz typu SCF z kullinami innymi niż kulli-

na 1, zamiast białek Skp 1 i białek Fbp, wy-

stępują białka pokrewne pełniące podobne

funkcje (K REK 2003, G UARDAVACCARO i P AGA -

NO 2004).

Białka Fbp rozpoznają i wiążą białka ma-

jące ulec ubikwitylacji, charakteryzuje je za-

Nagroda Nobla z chemii w 2004 roku

137

Ryc. 1. Schemat działania układu ubikwityna/proteasom.

E1 — enzym aktywujący ubikwitynę, E2 — enzym konjugujący i przenoszący ubikwitynę, E3 — ligaza ubikwi-

tylowa.

wsze obecność 40-aminokwasowej sekwencji

tzw. „F-box” oraz specyficznych sekwencji ta-

kich jak WD40 czy też LRR (ang. leucine rich

repeat), które biorą udział w interakcjach

białko-białko (C RAIG i T YERS 1999, C ARDOZO

i P AGANO 2004). Mutacje i/lub amplifikacje

kodujących je genów spotykane są w wie-

lu komórkach nowotworowych, jak również

w mięśniach ulegających atrofii. Białka te są

wysoce niestabilne, a degradacja przynajm-

niej niektórych z nich następuje w proteaso-

mie 26S. Białka Fbp występują praktycznie

we wszystkich badanych organizmach, w ko-

mórkach ssaków jest ich prawdopodobnie

kilkaset. Powszechność i liczebność podjed-

nostek w ligazach typu SCF powoduje, że

mogą być tworzone różne kompleksy tych

enzymów o wybiórczej specyficzności w sto-

Ryc. 2. Przykłady ligaz ubikwitylowych z domeną RING finger (RF).

Oligomeryczne ligazy typu SCF (A) i APC/C (B). C — monomeryczna ligaza CHFR; zaznaczono podstawowe

podjednostki lub domeny, których działanie opisano w tekście.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: