ROLA REGULACJI EKSPRESJI GENÓW W STABILNOŚCI PLAZMIDÓW.pdf

Tom 51, 2002

Numer 3 (256)

Strony 319–330

G RA¯YNA J AGURA -B URDZY

Zak³ad Biochemii Drobnoustrojów

Instytut Biochemii i Biofizyki PAN

Pawiñskiego 5a, 02-106 Warszawa

gjburdzy@ibb.waw.pl

ROLA REGULACJI EKSPRESJI GENÓW W STABILNOŒCI PLAZMIDÓW

Plazmidy, czyli niezale¿nie replikuj¹ce siê

pozachromosomalne elementy genetyczne

enetyczne wystêpuj¹ w Archea, Eubacteria i

Eukaryota. Najlepiej poznano biologiê plazmi-

dów u bakterii i tej grupie poœwiêcone bêd¹ ni-

niejsze rozwa¿ania. Plazmidy, zgodnie z przy-

jêt¹ definicj¹, nie s¹ niezbêdne komórce gospo-

darza do przetrwania ale czêsto zwiêkszaj¹

jego zdolnoœci adaptacyjne do zmieniaj¹cych

siê warunków œrodowiska. Ekspresja informa-

cji genetycznej, któr¹ nios¹ (stanowi¹ca niejed-

nokrotnie kilkanaœcie % informacji komórki)

mo¿e prowadziæ do obci¹¿eniametabolizmuw

takim stopniu, ¿e zmniejszy szansê gospodarza

w konkurencji z komórkami bezplazmidowy-

mi. Regulacja ekspresji genów plazmidowych

decyduje wiêc o sukcesie w rozprzestrzenia-

niu siê zarówno w linii pionowej (z pokolenia

na pokolenie, ang. vertical inheritance), jak i

horyzontalnie (poprzez „infekcjê” nowych ko-

mórek, ang. horizontal transfer).

Mówi¹c o plazmidach zwykle wymieniamy

cechy fenotypowe o jakie wzbogacaj¹ gospoda-

rza: opornoœci na antybiotyki czy metale ciê-

¿kie, zdolnoœæ rozk³adu zwi¹zków organicz-

nych, wykorzystanie ró¿nych zwi¹zków wêgla,

opornoœci na UV itp. Dla biologii plazmidów

najistotniejsze s¹ jednak operony odpowiedzial-

ne za replikacjê i mechanizmy stabilnego dzie-

dziczenia stanowi¹ce tzw. szkielet genetyczny

(ang. backbone). Dla wiêkszych plazmidów jest

to tak¿e zdolnoœæ zasiedlania nowych gospoda-

rzy w wyniku transferu koniugacyjnego (pla-

zmidy mobilizowalne czy koniugacyjne). Bada-

nia nad transkryptomem plazmidów IncP-1

(Thomas, dane nieopublikowane) wskazuj¹, ¿e

spoœród oko³o 60 genów plazmidu RK2 wysoki

poziom ekspresji charakteryzuje jedynie opero-

ny opornoœci na antybiotyki. Byæ mo¿e jest to

regu³a dla genówwarunkuj¹cych wymierne ko-

rzyœci adaptacyjne, a byæ mo¿e jest oznak¹ nie-

dawnego w³¹czenia tych genów do wyciszone-

go na drodze ewolucji t³a genetycznego, jakim

jest szkielet plazmidowego genomu.

Promotory operonów odpowiedzialnych

za replikacjê, stabilne utrzymywanie w komór-

kach czy transfer horyzontalny w przewa-

¿aj¹cej czêœci nale¿¹ do bardzo silnych sy-

gna³ów transkrypcyjnych, z których ekspresja

rzadko zachodzi konstytutywnie. Podlegaj¹

one regulacji negatywnej, zapewniaj¹c w ten

sposób potencjaln¹ mo¿liwoœæ wysokiego po-

ziomu ekspresji genom plazmidowym. Mo¿li-

woœæ, która przez wiêkszoœæ cyklu ¿yciowego

plazmidu jest jednak niewykorzystana. Induk-

cja ekspresji operonów jest rzadko u¿ywanym

mechanizmem regulacji transkrypcji, najlepiej

poznane przyk³ady dotycz¹ indukcji systemów

transferu koniugacyjnego i jeden z przyk³adów

bêdzie omówiony szczegó³owo.

REGULACJA PROCESU REPLIKACJI

Celem kontroli procesu replikacji plazmi-

du jest utrzymywanie œcis³ej liczby kopii, opty-

malnej dla okreœlonej wielkoœci plazmidu tak,

aby z jednej strony nie obni¿yæ zdolnoœci prze-

320

G RA¯YNA J AGURA -B URDZY

¿ycia gospodarza (ang. fitness) a z drugiej stro-

ny zabezpieczyæ przekazanie w czasie podzia³u

bakterii chocia¿ jednej kopii plazmidu ka¿dej

komórce potomnej (D EL S OLAR i wspó³aut.

1998)

Plazmidy wykorzystuj¹ do powielania siê

„fabryki replikacyjne” gospodarza. Sygna³ roz-

poczêcia replikacji w oriV (ang. origin — punkt

startu) plazmidu jest jednak zale¿ny od specy-

ficznego Inicjatora kodowanego przez sampla-

zmid: mo¿e to byæ bia³ko (zwane najczêœciej

Rep) lub inicjatorowe RNA (np. RNA II w pla-

zmidach typu ColE1). Generalnie kontrola ilo-

œci kopii plazmidu przebiega na etapie inicjacji

replikacji poprzez obni¿anie ekspresji genu

rep (E SPINOZA i wspó³aut. 2000). Najprostszy

negatywny mechanizm regulacyjny to auto-

genna represja. Wyjœciowowysoki poziom eks-

presji ( po podziale komórki i spadku iloœci ko-

pii plazmidu czy przejœciu genomu plazmido-

wego do biorcy w czasie koniugacji) jest repry-

mowany w miarê przybywania produktu, czyli

bia³ka Rep. Dla wielu plazmidów wykazano, ¿e

bia³ko Rep przyjmuje dwie formy: w postaci

monomeru wi¹¿e siê do powtórzonych se-

kwencji w oriV zwanych iteronami, aktywuje

oriV powoduj¹c „topnienie” dwuniciowej

struktury DNA i inicjuje replikacjê, natomiast

w postaci dimeru wi¹¿e siê do operatora w re-

gionie w³asnego promotora i blokuje tran-

skrypcjê (Ryc. 1) (C HATTORAJ 2000). W niektó-

Inny mechanizm regulacji ekspresji genu

rep równie czêsto wykorzystywany przez pla-

zmidy oparty jest na powstawaniu antysensow-

nego RNA, które poprzez oddzia³ywanie z

mRNA rep obni¿a jego trwa³oœæ, powoduje ate-

nuacjê, maskuje sygna³y translacyjne lub zwiêk-

sza powinowactwo dodatkowych elementów

regulacyjnych np. bia³ek represorowych

(W AGNER iS IMONS 1994, F RANCH iG ERDES

2000). Regulatorowe, antysensowne RNA jest

wysoce labilne, jego stê¿enie jest wiêc œciœle

proporcjonalne do iloœci kopii plazmidu. Spa-

dek iloœci kopii plazmidu, a tym samym regula-

torowego RNA, prowadzi do wzmo¿onej synte-

zy inicjatora. Najlepiej poznany system replika-

cji plazmidów typu ColE1, w których inicjacja

replikacji regulowana jest przez antysensowne

RNA (RNA I) nie zale¿y od bia³ka inicjatorowe-

go Rep: inicjatorem replikacji jest tu transkrypt

tzw. RNA II. Jego prawid³owe zwiniêcie siê i od-

dzia³ywanie z DNA w regionie oriV jest sy-

gna³em do wkroczenia RNazyH i PolI DNA oraz

rozpoczêcia replikacji plazmidu. Tworzenie

dwuniciowych struktur miêdzy RNA II i kom-

plementarnym do niego RNA I uniemo¿liwia

tworzenie hybrydu RNAII-DNA i blokuje repli-

kacjê.

Negatywna kontrola oparta na dzia³aniu re-

presorów, produktówniezale¿nych operonów

wydaje siê najrzadziej stosowanym sposobem

regulacji ekspresji genu rep . W takich przypad-

Ryc. 1. Autogenna regulacja genu rep.

Bia³ko Rep w postaci monomeru wi¹¿e siê z iteronami (powtórzone miejsca wi¹zania Rep) w regionie oriV i ini-

cjuje replikacjê. Wpostaci dimeru rozpoznaje operator w regioniew³asnego promotora i blokuje transkrypcjê.

rych plazmidach lokalizacja iteronów oriV w

regionie promotora rep umo¿liwia pe³nienie

ró¿nych funkcji przez tê sam¹ formê bia³ka Rep

w zale¿noœci od stê¿enia Rep. Co wiêcej, sam

proces replikacji mo¿e indukowaæ produkcjê

bia³ka Rep i nowe wydarzenia inicjacyjne po-

przez usuwanie represora Rep z miejsc opera-

torowych (profag P1) (M UKHOPADHYAY i

C HATTORAJ 2000).

kach sensorem iloœci kopii plazmidu staje siê

element niezale¿ny od samego procesu repli-

kacji. Interesuj¹cymprzyk³adems¹ tu plazmidy

IncP-1, w których ekspresja genu trfA (czyli

rep ) jest regulowana przez przynajmniej trzy

globalne represory KorA, IncC i KorB, produk-

ty tzwcentralnego operonu kontroli korAincC-

korB (P ANSEGRAU i wspó³aut. 1994).

Rola regulacji ekspresji genów w stabilnoœci plazmidów

321

Rozwój badañ nad replikacj¹ plazmidów

wyraŸnie wskazuje, ¿e proste mechanizmy

kontroli, chocia¿ skuteczne, ustêpuj¹ miejsca

kombinacji ró¿nych mechanizmów: autogen-

nej regulacji i regulacji przy udziale antysen-

sownego RNA czy antysensownego RNA i do-

datkowych bia³ek represorowych (D EL S OLAR i

E SPINOZA 2000).

REGULACJA EKSPRESJI OPERONÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA STABILNE DZIEDZICZENIE

PLAZMIDÓW

Plazmidy rozprzestrzeniaj¹ siê czynnie w

populacji gospodarza dwoma sposobami: prze-

kazywane s¹ do potomstwa w czasie podzia³u

komórki albo na drodze koniugacji/mobilizacji

„infekuj¹” bezplazmidowego dotychczas bior-

cê. Replikacja zapewnia w³aœciw¹ iloœæ kopii

plazmidu na komórkê zwiêkszaj¹c szansê prze-

trwania, a kodowane przez plazmidy systemy

mrs (ang. multimer resolution systems) maksy-

malizuj¹ iloœæ kopii separuj¹c powstaj¹ce dime-

ry/multimery. Podczas gdy ma³e plazmidy o du-

¿ej iloœci kopii bazuj¹ na losowej segregacji

cz¹steczek do komórek potomnych, du¿e pla-

zmidy o niskiej liczbie kopii (1–2 na komórkê)

aktywnie pomagaj¹ losowi stosuj¹c powszech-

nie dwa mechanizmy: aktywnego rozdzia³u

(ang. active aprtitioning) i niszczenia w popula-

cji tych bakterii, które przypadkowo straci³y

plazmid (ang. postsegregational killing, psk)

(G ERDES i wspó³aut. 2000a). Genomika plazmi-

dów dostarcza dowodów na „mobilnoœæ” tych

mechanizmów miêdzy ró¿nymi plazmidami.

Jest to mo¿liwe m.in. dziêki temu, ¿e s¹ kodowa-

ne przez zamkniête, samoregulowalne jednost-

ki transkrypcyjne, nazywane czêsto „kasetami”.

Systemy aktywnego rozdzia³u to operony

sk³adaj¹ce siê najczêœciej z dwóch genów parA i

parB i z miejsca centromero-podobnego parS

(przez analogiê do systemów eukariotycznych)

(G ERDES i wspó³aut. 2000b). W uproszczeniu

aktywny rozdzia³ przebiega nastêpuj¹co: bia³ko

typu B rozpoznaje i wi¹¿e parS , tworzy pary pla-

zmidów, które nastêpnie s¹ aktywnie separowa-

ne przy udziale aktywnoœci ATPazowej bia³ka

ParA i cz¹steczki plazmidów kierowane s¹ do

przeciwnych biegunów komórki w czasie jej

podzia³u. Istniej¹ dwa g³ówne typy systemów

aktywnego rozdzia³u oparte na budowie bia³ko-

wych sk³adników, lokalizacji centromeru i regu-

lacji ekspresji. W przypadku pierwszym iloœæ

bia³ka typu ParA (ATPaza z motywami Walkera)

jest limitowana (tak samo jak bia³ka ParB).

Bia³ko ParA jest autogennym represorem ope-

ronu parAparB i w tej funkcji jest wspomagane

przez ParB lub bia³ko ParB jest autorepresorem

wi¹¿¹c siê do centromeru w rejonie promotora

i w tej funkcji wspomagane jest przez ParA (Ryc.

2A, B). Zaburzenia relatywnych iloœci obu sk³ad-

nikówprowadz¹ do gwa³townej utraty (destabi-

lizacji) plazmidu. W przypadku plazmidu R1

Ryc. 2. Autoregulacja operonów aktywnego rozdzia³u.

Dwa modele autoregulacji s¹ przedstawione schematycznie: (A) g³ównym represorem jest ParA a ParB stabilizu-

je kompleksy ParA-DNA, centromer (miejsce oddzia³ywania ParB z DNA) wystêpuje bezpoœrednio za operonem

lub w odleg³ych miejscach; (B) lokalizacja centromeru pokrywa siê z promotorem operonu parAB i dziêki temu

ParB pe³ni równoczeœnie dwie funkcje — autorepresora i bia³ka podzia³owego.

322

G RA¯YNA J AGURA -B URDZY

(typ II) funkcjê autorepresora pe³ni bia³ko ParR

(homolog ParB), którego iloœæ w komórce wy-

nosi oko³o 1000 cz¹steczek. Nie jest to skutecz-

na autorepresja poniewa¿ poziom pierwszego

produktu operonu ParM (aktynopodobnej AT-

Pazy) wynosi oko³o 15000 monomerów

(M OLLER -J ENSEN i wspó³aut. 2002). Ró¿nice w

ekspresji obydwu genów wynikaj¹ z inhibicji

translacji parB z policistronowego mRNA (ang.

translation coupling). ParM oddzia³ywuje z

kompleksem parS -ParR i polimeryzuj¹c tworzy

dynamicznie aktywne d³ugie struktury sepa-

ruj¹ce przestrzennie cz¹steczki plazmidu do

biegunów- jest to pierwszy przyk³ad analoga

wrzeciona podzia³owego u bakterii. Z punktu

widzenia regulacyjnego jest to te¿ wyj¹tek od

klasycznej regu³y „wyciszania” ekspresji genów

plazmidowych.

Systemy posegregacyjnego zabijania psk,

mimo swojej ró¿norodnoœci i wyspecjalizowa-

nia w dzia³aniu na ró¿ne „cele” w komórce, ba-

zuj¹ na ró¿nicach w stabilnoœci toksyny i od-

trutki (G ERDES i wspó³aut. 2000a). W opero-

nach psk, które koduj¹ dwa bia³kowe sk³adniki

albo sama odtrutka albo w kompleksie z tru-

cizn¹ odpowiada za autoregulacjê. W niektó-

rych plazmidach jak np. pSM19035 z grupy

inc18 w operonie trucizny ( ) i odtrutki ( )po-

jawia siê niezale¿ny regulator omega, sk³adnik

tego samego operonu ( - - ), który pe³ni funk-

cjê autorepresora (Ryc. 3) ( DE L A H OZ i

wspó³aut. 2000). W systemach gdzie odtrutk¹

jest antysensowne niestabilne RNA (np.

hok/sok w plazmidzie R1) transkrypcja zacho-

dzi konstytutywnie, a regulacja ekspresji jest

posttranskrypcyjna. Mechanizm hok/so k by³

pierwszym szczegó³owo poznanym mechani-

zmem potranskrypcyjnej regulacji ekspresji

genów przy zastosowaniu antysensownego

RNA (T HISTED i wspó³aut. 1995).

REGULACJA EKSPRESJI OPERONÓW TRANSFERU KONIUGACYJNEGO

Transfer koniugacyjny plazmidów jest jed-

nym z najistotniejszych procesów w horyzon-

talnym rozprzestrzenianiu siê genóww biosfe-

rze (Z ECHNER i wspólaut. 2000). Generalnie

proces koniugacji sk³ada siê z dwóch etapów:

(i) przygotowania DNA plazmidu do trans-

feru tzw funkcje Dtr (ang. DNA transfer and re-

plication);

(ii) zbudowania mostu koniugacyjnego

miêdzy biorc¹ i dawc¹ (agregaty koniugacyjne

u bakterii Gram dodatnich czy kontakt przy

udziale pilusa u bakterii Gram-ujemnych) czyli

funkcje Mpf (ang. mating pair formation).

Kompleksy bia³kowe bior¹ce udzia³ w tych

dwóch etapach s¹ kodowane w du¿ych jed-

nostkach transkrypcyjnych, przestrzennie roz-

dzielonych. Podczas gdy funkcje Dtr s¹ plazmi-

dowo-specyficzne (kompleks relaksazy rozpo-

znaje i nacina jedn¹ niæ tylko w oriT w³asnego

plazmidu), funkcje Mpf plazmidów z bakterii

Gram-ujemnych czêsto wykorzystywane s¹ do

transportu przez inne plazmidy obecne w ko-

mórce bakterii (plazmidy mobilizowalne).

Funkcje Dtr razem z Mpf zajmuj¹ od 20–40kb,

stanowi¹ oko³o 50% informacji genetycznej

plazmidów koniugacyjnych, nic wiêc dziwne-

go, ¿e ich ekspresja musi byæ œciœle kontrolo-

wana.

Wœród plazmidów koniugacyjnych rozró¿-

niamy takie, które czekaj¹ na sygna³ do koniu-

gacji utrzymuj¹c funkcje Dtr/Mpf w stanie

„utajnionym” i takie, które s¹ w ci¹g³ej gotowo-

œci do transferu chocia¿ jest to gotowoœæ na mi-

nimalnym poziomie (Z ATYKA iT HOMAS 1998).

Najlepiej poznanym (i najwczeœniej odkrytym)

jest system koniugacyjny plazmidu F (i plazmi-

dów pochodnych R1 czy R100) zakodowany w

oko³o 40 genach regionu tra. Oko³o po³owa

bia³ek Tra uczestniczy w syntezie piliny i budo-

wie F-pilusa. Region tra znajduje siê za oriT i

sk³ada siê z trzech jednostek transkrypcyjnych,

dwóch mono traM , traJ i jednego multicistro-

nowego operonu traY . TraJ jest aktywatorem

promotora traY . Ekspresja traJp jest z kolei mo-

dulowana przez mRNA finP (antysensowne

RNA, negatywny efektor translacji TraJ) i

bia³ko FinO, produkt ostatniego genu operonu

traY (stabilizator dupleksu mRNA finP -m-

RNA traJ ). Dzia³anie FinOP (ang. fertility inhi-

bition) skutecznie wy³¹cza gen traJ i tym sa-

mym operon traY, jedynie oko³o 0.1% komó-

rek w populacji gospodarza R1 czy R100 jest

zdolna do transferu. Dziêki mutacji insercyjnej

IS3 w genie finO prowadz¹cej do czêœciowej

derepresji traJp populacja gospodarza plazmi-

du F jest w 100% zdolna do transferu i to sprzy-

ja³o odkryciu zjawiska koniugacji u bakterii i

skorelowania go z wystêpowaniem plazmidu F

(L EDERBERG iT ATUM 1946).

Plazmidy IncP-1 s¹ plazmidami o bardzo

szerokim spektrum gospodarzy — mog¹ siê re-

plikowaæ i stabilnie utrzymywaæ we wszyst-

Rola regulacji ekspresji genów w stabilnoœci plazmidów

323

Ryc. 3. Regulon Omega w plazmidzie pSM19035 ( inc18 ).

Represor Omega ( ) rozpoznaje krótkie sekwencje nukleotydów wystepuj¹ce jako bezpoœrednie lub odwróco-

ne powtórzenia w promotorach copS (determinuj¹cego iloœæ kopii plazmidu), , koduj¹cego homolog ParA i

- -

kich badanych bakteriach Gram-ujemnych

(P ANSEGRAU i wspó³aut. 1994). Ich system ko-

niugacyjny ma jeszcze szerszy zasiêg: plazmidy

IncP-1 mog¹ byæ przenoszone koniugacyjnie

do bakterii Gram-dodatnich i komórek euka-

riotycznych (H EINEMANN iS PRAGUE 1989).

Funkcje Dtr zakodowane s¹ w regionie tra

(Tra1) wdwóch jednostkach transkrypcyjnych

traJIHGFEDCBA it raKLM , których przeciwnie

skierowane promotory obejmuj¹ oriT (miejsce

inicjacji transferu koniugacyjnego). Kompleks

relaksazy TraJ/TraI/TraK wi¹¿¹c siê do oriT i

wprowadzaj¹c jednoniciowe naciêcie jedno-

czeœnie pe³ni funkcjê autoregulatora obydwu

promotorów. Drugi multicistronowy operon

trb (Tra2) koduje funkcje Mpf. Produktem

pierwszego genu tego operonu — trbA jest

bia³ko represorowe, które jest g³ównym regula-

Ryc. 4. Regulacja ekspresji operonów transferu koniugacyjnego w plazmidzie pTiC58 z A. tumefa-

ciens .

OccR i TraR s¹ aktywatorami transkrypcji, do swojej funkcji wymagaj¹ niskocz¹steczkowych kofaktorów — spe-

cyficznych opin, produktu uszkodzonych komórek roœlinnych (OccR) i pochodnej laktonu homoseryny AAI

(TraR). Ekspresja traR jest zale¿na od kompleksu OccR-opiny. Autoinduktor AAI jest produktem syntazy TraI. Ni-

ski poziom podstawowy AAI jest niewystarczaj¹cy do aktywacji TraR ale wzrasta wraz ze wzrostem liczby komó-

rek-dawców (gêstoœci¹ populacji). Przekroczenie poziomu progowego indukuje kaskadêwydarzeñ transkrypcyj-

nych poprzez autoindukcjê traI i traR. Wi¹zanie TraR-AAI w regionie promotora traItrb indukuje transkrypcjê

równie¿ z przeciwnie skierowanego promotora operonu repABC odpowiedzialnego za replikacjê wegetatywn¹ i

aktywny rozdzia³ plazmidów.

koduj¹cego system stabilizacyjny typu psk .

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: