Mapowanie mejotyczne.
Część teoretyczna:
Mapowanie genów: służy do ustalenia położenia danego genu w chromosomie (s) oraz odległości pomiędzy genami. Podczas mapowania genów badamy czy dwa różne geny są sprzężone ze sobą tzn. czy leżą blisko siebie na jednym chromosomie. Geny niesprzężone leżą bądź bardzo daleko od siebie na tym samym chromosomie lub na różnych chromosomach niehomologicznych. Miarą odległości między genami lub między genem a centromerem chromosomu jest częstość rekombinacji w obrębie mierzonego obszaru chromosomu, czyli de facto liczba crossing-over w tym obszarze podczas podziału mejotycznego między czterema chromatydami dwóch chromosomów homologicznych. Aby ustalić odległość między badanymi genami należy wziąć po uwagę osobniki zrekombinowane i niezrekombinowane. Stosunek liczby osobników zrekombinowanych do liczby ogólnie przebadanych osobników wyznacza odległość między mapowanymi genami.
Mapowanie mejotyczne u drożdży S. cerevisiae:
Dzięki temu, że u drożdży występuje faza haploidalna, możemy bezpośrednio obserwować fenotyp produktów mejozy w postaci potomstwa spor pochodzącego z jednego worka i nie musimy dokonywać krzyżowania testowego heterozygoty z homozygotą recesywną. W celu zmapowania dwóch różnych genów u drożdży dokonujemy np. krzyżowania dwóch haploidalnych szczepów, z których jeden rodzic ma dwa geny typu dzikiego (zdolność do syntezy uracylu i adeniny: URA3 i ADE2), a drugi rodzic ma oba te geny zmutowane (brak wzrostu na podłożu minimalnym bez uracylu i adeniny: ura3 i ade2). Uzyskany diploid posiada zdolność do syntezy uracylu i adeniny dzięki komplementacji produktów genów niezmutowanych, pochodzących od jednego z rodziców (URA3/ura3 ADE2/ade2). Następnie w diploidzie indukujemy sporulację na podłożu z dodatkiem octanu potasu i niewielkiej ilości glukozy. Spory w worku są bezpośrednimi produktami mejozy i niektóre z nich mogą zawierać zrekombinowane chromosomy powstałe w trakcie pierwszego podziału mejotycznego. Naszym celem jest określenie fenotypu każdej z czterech spor pochodzących z tego samego worka. Pozwoli to na identyfikację zrekombinowanych spor o fenotypie innym niż szczepy rodzicielskie w danej tetradzie. W tym celu ściany worków trawimy specjalnym enzymem np. zymolazą lub glukuronidazą, ale dzięki dużej lepkości spory z jednego worka pozostają razem i rozdzielamy je przy pomocy igły umieszczonej w mikromanipulatorze (disekcja, Rys. 1). Każda ze spor tetrady kiełkuje i tworzy kolonię, której fenotyp możemy określić przez replikowanie tetrad na odpowiednie podłoża selekcyjne (w naszym przykładzie na podłoża minimalne bez uracylu lub bez adeniny).
Jeśli mamy do czynienia z dwoma genami położonymi na tym samym chromosomie i nie dochodzi do żadnego crossing-over między chromatydami chromosomów homologicznych, to wówczas po rozdzieleniu czterech chromatyd otrzymamy w tetradzie dwie spory o fenotypie jednego z rodziców (URA3 ADE2, dwie spory będą zdolne do wzrostu na podłożu bez adeniny i uracylu) i dwie spory o fenotypie drugiego z rodziców (ura3 ade2, dwie spory nie będą rosły na podłożu bez uracylu i adeniny). Jako że mamy dwa typy spor (dwa typy fenotypów) i oba typy są identyczne fenotypami fenotypami rodziców, taką tetradę nazywamy dwutypem rodzicielskim PD (ang. Parental Ditype) (Rys. 2).
Rys. 1. Disekcja i analiza tetrad u drożdży S. cerevisiae.
Rodzice: URA3 ADE2 i ura3 ade2 Tetrada PD: 2 x URA3 ADE2
2 x ura3 ade2
Rys. 2. Schemat powstawania worka rodzicielskiego PD.
Jeśli geny leżą w większej odległości od siebie, wówczas może dojść do pojedynczego crossing-over między dwoma niciami , w wyniku którego powstają dwie zrekombinowane chromatydy. Po rozdzieleniu czterech chromatyd otrzymamy w tetradzie po dwie spory typu rodzicielskiego (URA3 ADE2, zdolność do wzrostu na podłożu bez adeniny i uracylu oraz ura3 ade2, spora nie będzie rosła na podłożu bez uracylu i adeniny) oraz po dwie spory o fenotypie nierodzicielskim po rekombinacji (ura3 ADE2, zdolność do wzrostu na podłożu bez adeniny, ale brak wzrostu na podłożu bez uracylu oraz URA3 ade2, spora nie będzie rosła na podłożu bez adeniny, ale będzie rosnąć na podłożu bez uracylu). Jako że mamy cztery typy spor (cztery typy fenotypów), taką tetradę nazywamy tetratypem TT (ang. Tetratype) (Rys. 3).
Rodzice: URA3 ADE2 i ura3 ade2 Tetrada TT: 1 x URA3 ADE2
1 x URA3 ade2
1 x ura3 ADE2
1 x ura3 ade2
Rys. 3. Schemat powstawania worka tetratypowego TT.
Rodzice: URA3 ADE2 i ura3 ade2 Tetrada NPD: 1 x URA3 ade2
Rys. 4. Schemat powstawania worka nierodzicielskiego NPD.
Podczas mejozy może dojść także do czteroniciowego podwójnego crossing-over, w wyniku którego wszystkie chromatydy są zrekombinowane (Rys. 4). W tetradzie powstają dwa typy spor, ale wszystkie mają inny fenotyp niż wyjściowe szczepy rodzicielskie. Taką tetradę nazywamy dwutypem nierodzicielskim NPD (ang. Non-Parental Ditype). W naszym przykładzie dwie spory będą rosły na podłożu bez uracylu, ale nie będą rosły na podłożu bez adeniny (URA3 ade2). Pozostałe dwie spory będą rosły na podłożu bez adeniny, ale nie będą rosły na podłożu bez uracylu (ura3 ADE2).
Jeśli dwa geny leżą bardzo blisko siebie, to wtedy będą powstawać tylko worki typu PD. Im geny leżą dalej od siebie, tym więcej będzie powstawać worków typu TT i NPD. Odległość między genami obliczami sumując liczbę zrekombinowanych worków i dzieląc przez całkowitą liczbę analizowanych worków. Do liczby zrekombinowanych worków bierzemy tylko połowę worków tetratypowych, gdyż w tym worku tylko połowa spor powstała w wyniku rekombinacji. Całość mnożymy przez 100% dając końcowy wynik częstości rekombinacji będący miarą odległości między genami. 1% rekombinacji równa się 1cM (centymorgan).
Gdy geny jednak leżą w większej odległości od siebie, może dochodzić do dwuniciowych i trzyniciowych podwójnych crossing-over, które skutkują powstaniem albo worka PD lub TT (Rys. 5), a nie NPD. Zatem liczba worków NPD jest niedoszacowana w tym wzorze. Liczymy więc wszystkie teoretyczne możliwości rekombinacji, które są sumą pojedynczych crossing-over (C-O) i podwójnych crossing-over (DC-O) pomnożonych prze dwa, gdyż są wynikiem jednoczesnego zajścia dwóch pojedynczych crossing-over:
liczba rekombinacji = C-O + 2 (DC-O)
Teoretycznie mogą się zdarzyć cztery rodzaje podwójnego crossing-over (Rys. 4 i 5) i mogłyby powstać 4 worki NPD (w rzeczywistości powstaje tylko jeden worek NPD oraz dwa worki TT i jeden worek PD); częstość teoretyczna podwójnego crossing-over równa się 4NPD. Liczba pojedynczych crossing-over powinno się równać ilości worków TT, ale należy pomniejszyć o dwa teoretyczne worki NPD, które wyglądają jak TT, ale nie powstały w wyniku pojedynczego crossing-over, lecz podwójnego trzyniciowego crossing-over. Zatem:
liczba rekombinacji (C-O) = C-O + 2 (DC-O) = TT – 2NPD + 2 (4NPD) = TT + 6NPD
Częstość rekombinacji otrzymujemy dzieląc liczbę C-O przez liczbę zdarzeń; miarą C-O będzie liczba TT + 6NPD, a całkowitą liczbą zdarzeń będzie analizowana liczba tetrad. Całość mnoży się przez 100, aby uzyskać procentową częstość rekombinacji oraz przez ½, gdyż w wyniku pojedynczego C-O powstają tylko dwie zrekombinowane spory w tetradzie, a my bierzemy pod uwagę liczbę całych tetrad, a nie liczbę spor.
DC-O dwuniciowe PD
DC-O trzyniciowe Tetratyp
Rys. 5. Schemat powstawania worków PD i TT po podwójnym crossing-over.
9
Otrzymujemy następujący wzór:
Wzór ten można stosować dla genów leżących stosunkowo blisko siebie (do 35 cM). Im geny leżą dalej od siebie tym częstość niezauważalnych podwójnych crossing-over wzrasta w obszarze między tymi genami i odległość liczona między dwoma genami obarczona jest coraz większym błędem (odległość jest mniejsza od rzeczywistej). W tej sytuacji lepiej stosować tzw. krzyżówkę trzypunktową, w której badamy odległości między trzema genami ułożonymi liniowo na jednym chromosomie.
Mapowanie mejotyczne możemy także wykorzystać do obliczania odległości genu od centromeru. W takiej sytuacji musimy znać gen, który leży bardzo blisko centromeru (gen sprzężony z centromerem) i względem którego będziemy obliczać odległość naszego genu.
Podsumowując, jeśli po analizie tetrad otrzymamy bardzo różną liczbę worków PD i NPD, to wtedy wnioskujemy, że geny leżą na jednym chromosomie. Duża liczba worków PD i mała liczba worków NPD i TT świadczyć będzie o bliskim położeniu obu genów (mówimy wtedy o sprzężeniu obu genów). Jeśli po analizie tetrad otrzymujemy dużą liczbę tetrad NPD i TT, wtedy wnioskujemy, że geny leżą na jednym chromosomie, ale nie są sprzężone, czyli leżą w większej odległości od siebie. Odległość tę możemy obliczyć używając powyższego wzoru na częstość rekombinacji.
W wyniku analizy tetrad możemy również otrzymać podobną liczbę worków typu PD i NPD. Oznacza to, że badane geny leżą na różnych niehomologicznych chromosomach. Wniosek ten wynika z drugiego prawa Mendla, czyli zasady losowego i niezależnego od siebie rozchodzenia się chromosomów podczas tworzenia gamet (w przypadku drożdży - spor). Podczas pierwszego podziału mejotycznego chromosomy homologiczne tworzą pary i ustawiają się w płytce równikowej komórki; następnie się rozdzielają i wędrują do przeciwległych biegunów komórki; istnieje 50% szans, że dany chromosom homologiczny z jednej pary powędruje do jednego z biegunów (Rys. 6). Załóżmy, że skrzyżowaliśmy haploidalny szczep dziki (ADE2 URA3) ze szczepem, który wymaga do wzrostu na podłożu minimalnym tryptofanu i uracylu (ade2 ura3). Oba geny leżą na różnych niehomologicznych chromosomach. Uzyskany szczep diploidalny ma fenotyp typu dzikiego dzięki zjawisku komplementacji (ADE2/ade2 URA3/ura3). Jeśli podczas pierwszego podziału mejotycznego do jednego bieguna komórki przejdą chromosomy zawierające zmutowane allele (ade2 ura3), a do drugiego bieguna przejdą chromosomy z allelami niezmutowanymi, to powstaną spory typu rodzicielskie i tetrada PD. Z takim samym prawdopodobieństwem do jednego z biegunów komórki może przejść chromosom z allelem typu dzikiego URA3 i drugi chromosom z allelem zmutowanym ade2, a do drugiego bieguna przejdzie chromosom ze zmutowanym allelem ura3 i chromosom z dzikiem allelem ADE2 (Rys. 6). W takim przypadku powstanie worek NPD ze wszystkimi sporami nierodzicielskimi (ade2 URA3 lub ADE2 ura3). W przypadku analizy genów leżących na różnych chromosomach mogą powstawać także worki typu TT, jeśli geny leżą w różnych odległościach od swoich centromerów i z różną częstością będzie zachodzić crossing-over między tymi genami a centromerami. Jeśli w trakcie mejozy tylko jedna para chromosomów homologicznych będzie brała udział w crossing-over, np. chromosomy z genem ADE2, to wówczas powstanie worek typu TT (Rys. 7). Jeśli crossing-over zajdzie jednocześnie w obu parach chromosomów homologicznych, to powstanie z 50% szansą worek PD lub NPD.
Powstanie worka typu PD lub
powstanie worka typu NPD
Rys. 6. Schemat powstawania worków PD i NPD, gdy geny leżą na różnych chromosomach.
...
Kasiaaa_aaa