Przemysław Kraska gr. III

Oznaczanie aktywności proteolitycznej trypsyny.

Wykonanie:

Do 2 czystych probówek odmierzamy po 2ml białka i wstawiamy na około 5 minut do łaźni wodnej ustawionej na temperaturę 37°C. Następnie do jednej probówki (próba pełna) dodajemy 1ml enzymu z kolby miarowej, szybko mieszamy i z powrotem wstawiamy do łaźni na 15 minut. Po tym czasie do obu probówek dodajemy po 5ml kwasu trichlorooctowego, a do probówki drugiej (próba materiałowa) dodajemy jeszcze 1ml enzymu z kolby miarowej. Wszystkie próby mieszamy i pozostawiamy przez 30 minut w celu całkowitego wytrącenia osadu białka. Następnie próby przesączamy do suchych probówek przez sączek z bibuły.

Aby oznaczyć zawartość tyrozyny w produktach proteolizy , musimy do 4 probówek odmierzyć z próby pełnej i materiałowej w dwóch powtórzeniach po 2ml odbiałczonego przesączu. Następnie do każdej probówki dodajemy 4ml 0,5- molowego wodorotlenku sodowego, po czym przy stałym wstrząsaniu 1,2ml odczynnika Folina i zawartość probówek dobrze mieszamy. Po 10 minutach odczytujemy absorbancję poszczególnych prób w fotometrze przy długości fali 670nm ustawiając na zero wobec wody.

Wyniki:

Pomiar w fotometrze dał następujące wyniki:

Średnia z próby pełnej 0,343 a z materiałowej 0,168.

Od średniej prób pełnych odejmujemy średnią prób mateiałowych:

ΔA= 0,343 – 0,168

ΔA= 0,175

Różnica ta pozwala na odczytanie z krzywej wzorcowej ilość mikromoli tyrozyny zawartej w peptydach: mój odczyt to 0,127μm

Teraz wyliczamy ilość mikromoli tyrozyny uwolnionych przez 1ml trypsyny w ciągu 15 minut:

0,127 x 4 x 10

15’

wynik to 0,338μm.

Wyliczamy ilość mg trypsyny z metody krzyżowej:

7mg – 40ml

   x – 2ml

wynik to 0,35mg.

Teraz  wyliczamy aktywność tyrozyny z metody krzyżowej:

0,35mg – 0,338μm

   1mg – x

wynik to 0,965 μm.

Aktywność wynosi 0,965 μm tyrozyny uwolnionych w ciągu 1 minuty przez 1ml trypsyny.

Wnioski:

Na ćwiczeniach do oznaczenia szybkości reakcji enzymatycznej katalizowanej przez trypsynę użyliśmy metody Ansona.

Polega ona na pomiarze ilości tyrozyny zawartej w peptydach uwolnionych w trakcie hydrolizy, które nie wytrącają się 3-procentowym kwasem trichlorooctowym.

1