Kierunek:  Technologia Żywności i Żywienie Człowieka

Przedmiot: Enzymologia

Temat ćwiczenia:

HYDROLIZA SACHAROZY – WYZNACZANIE STAŁEJ MICHAELISA DLA INWERTAZY DROŻDŻOWEJ

Wprowadzenie:

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26) jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza. U ludzi inwertaza, podobnie jak laktaza, występuje na wewnętrznej powierzchni komórek nabłonka wyściełającego jelito cienkie. Inwertaza występuje też w ślinie pszczół i bierze udział w przetwarzaniu cukru z nektaru kwiatowego do cukrów prostych.

W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem. Podczas produkcji nadzienie w postaci stałej (głównym składnikiem jest sacharoza) pokrywane jest czekoladą, a następnie w ciągu kilkutygodniowego „dojrzewania“ czekoladek w wyniku działania inwertazy dodanej w procesie produkcji, sacharoza rozkładana jest do fruktozy i glukozy, które chłonąc wilgoć ze środowiska powodują w efekcie upłynnienie nadzienia.

Celem ćwiczenia jest poznanie właściwości hydrolitycznych inwertazy z drożdży.

Wykonanie ćwiczenia:

Zadanie 1. Oznaczanie aktywności inwertazy

Przygotować 5% roztwór sacharozy (stężenie substratu ustalić z prowadzącym). Do zlewki wprowadzić 10 ml roztworu substratu, a następnie dodać 1 ml roztworu enzymu lub roztworu drożdży. Pobierać próbkę co 1 – 5 min (w zależności od otrzymywanych wyników – czas ustalać z prowadzącym) i sprawdzać stężenie glukozy metodą Luffa-Schoorla, wg dołączonej metodyki. Reakcję prowadzić, w zależności od wyników, przez 5 – 25 min.

Badanie powtórzyć dla innego stężenia substratu.

Narysować wykres oraz wyznaczyć rząd reakcji, stałą szybkości reakcji k i szybkość początkową dla każdego stężenia substratu. W przypadku oznaczeń dla kilku stężeń substratu wyznaczyć KM oraz Vmax.

Oznaczanie cukrów redukujących metodą Luffa-Schoorla

Do 6 probówek wprowadzić po 0,75 ml NaOH. Pobierać mieszaninę reakcyjną (0,5 ml) wg schematu czasowego (0; 2,5; 5; 10; 15; 20 min) i dodawać do kolejnych probówek, oznaczonych od 1 do 6. Do przesączu dodać 1 lub 2 ml odczynnika Luffa-Schoorla i wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 15 min. Ostudzić pod wodą, przesączyć, osad przemyć 2-3 krotnie wodą dest., zmierzyć obj. przesączu i uzupełnić obj. do 5 ml. Zmierzyć absorbancję przesączu przy dł. fali 754 nm, stężenie glukozy wyliczyć z krzywej wzorcowej.

y=-0,035x + 0,9422

Zadanie 3. Powtórzyć doświadczenie 2, dodając do enzymu NaCl w takiej ilości, by otrzymać ostateczne stężenie w próbie 10%.

Zadanie 4. Wyniki zestawić w tabeli/tabelach oraz przedstawić na wykresie/wykresach (zależność stężenia produktu od czasu, stężenia substratu od czasu, wykres Michaelisa-Menten i Lineweavera-Burka). Określić działanie NaCl na przebieg reakcji enzymatycznej.

Zadanie 6. Oznaczyć stężenie enzymu w roztworze metodą biuretową.

Oznaczanie stężenia białka metodą biuretową:  Do kolbek odmierzyć po 0,5 cm3 kolejnych prób (do próby ślepej użyć wody destylowanej), dodać po 2 cm3 odczynnika miedziowego. Wszystkie próby wykonywać w 3 powtórzeniach. Po 30 min odczytać absorbancję przy długości fali 540 nm. Zawartość białka odczytać z krzywej wzorcowej (po uwzględnieniu zmętnienia), zestawić wyniki, biorąc pod uwagę rozcieńczenie.

Zagadnienia do przygotowania:

1.      Wpływ różnych czynników na szybkość reakcji enzymatycznych.

2.      Inwertaza i oksydaza glukozowa.

Inwertaza (E.C. 3.2.1.26) jest enzymem katalizującym reakcję hydrolizy sacharozy do fruktozy i glukozy. Inwertaza jest wytwarzana przez komórki drożdży, pozwala rozłożyć sacharozę do łatwo przyswajalnych cukrów prostych, jakimi są glukoza i fruktoza.

W przemyśle spożywczym inwertaza jest wykorzystywana np. podczas produkcji czekoladek nadziewanych półpłynnym nadzieniem.

3.      Izolacja i oczyszczanie enzymów.

Enzymy są przeważnie bardzo nietrwałe w środowisku o pH mniejszym niż 5 lub większym niż 9, łatwo ulegają też denaturacji cieplnej (powierzchniowej - podczas pienienia się roztworów) oraz są inaktywowane przez metale ciężkie.

Izolowanie należy przeprowadzać w taki sposób, aby zapobiegać utracie zdolności katalitycznych, tzn.

-                    w buforach o pH około 7,

-                    w niskiej temperaturze (najczęściej około 0oC),

-                    stosując wodę podwójnie destylowaną oraz

-                    środki kompleksujące metale ciężkie, a w razie konieczności również związki tiulowe,

-                    zachowując wyjątkową czystość na stanowisku pracy.

Oczyszczanie enzymów

Dla każdego enzymu powinno się zastosować indywidualny schemat oczyszczania wykorzystujący jego własności fizykochemiczne.

1)        1 etap oczyszczania białek jest przeprowadzenie ich do roztworu, chyba że izolujemy je z płynnego źródła (np. z krwi, śliny itp.). Stosuje się w tym celu techniki doprowadzające do zniszczenia ścian, błon komórkowych lub struktury całych komórek, takie jak: -degradacja ścian komórkowych, czynniki biologiczne - lizozym, ciśnienie enzymatyczne (sól, cukier), ultradźwięki, homogenizacja, rozrywanie komórek piaskiem lub perełkami szklanymi, inne metody mechaniczne,

     Enzymy rozpuszczalne łatwo poddają się procesowi ekstrakcji wodą lub rozcieńczonymi roztworami soli i buforami. Natomiast związane z błonami wymagają użycia roztworów detergentów lub rozpuszczalników organicznych, które rozpuszczają lipidy, dalsze czynności zależą od konkretnego enzymu

2) 2 etap to wstępne procesy oczyszczania:

- frakcjonowanie roztworami soli (np. siarczanem amonu)

- ekstrakcja rozpuszczalnikami organicznymi (np. etanolem, acetonem lub eterem).

Metody te opierają się na odciągnięciu wody z roztworów koloidalnych, jakie tworzą białka (w tym enzymy) ponieważ białka są cząsteczkami zawierającymi różne ilości gr kwas i zasad ich rozpuszczanie zależy od stęż soli, polarnosci i pH rozpuszczalnika i temp. Dlatego pewne białaka wypadają z roztworów, podczas gdy inne w tych samych warunkach nadal tworzą roztwór koloidalny (nie można doprowadzić do denaturacji bialka). Otrzymane osady białkowe oddziela się przez wirowanie lub filtracyjne. Następnie są oczyszczane za pomocą dializy.

3)             3 etap - chromatografia,

-elektroforeza, analityczne, diagnostyczne badanie metodą – bibułowa, żelowa, swobodna.

-ultrawirowanie, wykorzystuje znacznie wyższe przeciążenia (nawet powyżej 600 000 x g).

- krystalizacja w najczystszych jednorodnych białkach z roztworów już oczyszczonych poprzednimi metodami.

Duże znaczenie w procesach oczyszczania białek mają techniki elektroforetyczne. Podobnie jak metody chromatograficzne mają one zastosowanie w przypadku wykonywania badań analitycznych (np. określania stopnia czystości izolowanych enzymów) jak i badań preparatywnych, wykonywanych w celu oczyszczenia białka.

4)             4 etap kontrola

- jakościowej (wzrastająca czystość białka),

- ilościowej (badanie stężenia i/lub jego aktywności).

Kontrole jakościową wykonuje się wykorzystując techniki elektroforetyczne (zwłaszcza SDS-PAGE). Do oznaczania stężenia enzymów wykorzystywane są zazwyczaj techniki spektrofotometryczne, np. metoda Lowry’ego, metoda biuretowa. Oznaczanie aktywności enzymów wykonuje się w oparciu o ich zdolności katalityczne, badamy i porównujemy z wzorcem

Literatura:

1.      Kłyszejko-Stefanowicz L. (red.): „Ćwiczenia z biochemii”, PWN Warszawa - Poznań 1982.

2.      Stryer L.: „Biochemia”, PWN Warszawa 1986.

3.      Dziuba J., Kostyra H.: „Biochemia żywności (metody, zadania i testy)”, Wydawnictwo UW-M w Olsztynie, Olsztyn 2000.

4.      Kołakowski E., Bednarski W., Bielecki S. „Enzymatyczna modyfikacja składników żywności”, Akademia Rolnicza w Szczecinie, Szczecin 2005.

4