skrypt.pdf

WYBRANE ELEMENTY BIOTECHNOLOGII ANTYBIOTYKÓW

Termin „ antybiotyk ” został wprowadzony po raz pierwszy w 1942 roku przez

Waksmana dla określenia substancji wytwarzanych przez drobnoustroje i posiadających

zdolność zabijania lub hamowania wzrostu bakterii. W chwili obecnej definicja ta obejmuje

zarówno związki pochodzenia naturalnego, jak i otrzymane w wyniku chemicznej lub

mikrobiologicznej modyfikacji struktur produktów naturalnych. Znane są również antybiotyki

wytwarzane wyłącznie syntetycznie, np. chloramfenikol, cykloseryna, karbapeny. Stąd też

dawne pojęcie antybiotyków jako substancji naturalnych, produktów wtórnego metabolizmu

mikroorganizmów, o aktywności bakteriobójczej lub bakteriostatycznej uległo zmianie, tym

bardziej, iż w kolejnych latach poznano nowe kierunki ich działania, np.

przeciwnowotworowe.

Antybiotyki należą do grupy leków charakteryzującej się różnorodnością budowy

chemicznej, co utrudnia ich klasyfikację. Uwzględniając jednakże ich wspólne cechy

strukturalne możemy wyodrębnić następujące grupy antybiotyków:

antybiotyki β-laktamowe (penicyliny, cefalosporyny, monobaktamy, karbapeny,

nokardycyny);

2. antybiotyki aminoglikozydowe (streptomycyna, kanamycyna, gentamycyna,

paromomycyna, neomycyna, framycetyna, tobramycyna, sisomycyna, amikacyna,

netromycyna);

antybiotyki tetracyklinowe (tetracyklina, chlorotetracyklina, oksytetracyklina,

demeklocyklina, metacyklina, doksycyklina);

antybiotyki makrolidowe (erytromycyna, karbamycyna, spiramycyna,

leukomycyna, rosaramycyna, awermektyna, azitromycyna);

ryfamycyny (ryfamycyna B i SV, ryfamid);

antybiotyki monoaminokwasowe (chloramfenikol, cykloseryna, tiamfenikol),

antybiotyki polipeptydowe (polimyksyny, kapreomycyna, wiomycyna,

tyrocydyna, gramicydyna, mikamycyna);

makrolidy polienowe (nystatyna, amfoterycyna B, fumagilina)

9. antybiotyki linkozamidowe (linkomycyna, klindomycyna);

10. antybiotyki glikopeptydowe (wankomycyna, teikoplanina);

11. antybiotyki lipopeptydowe (ramoplanina);

12. antybiotyki o różnej budowie (spektynomycyna, kwas fusydowy, gryzeofulwina,

fosfomycyna).

Ze względu na aktywność biologiczną, antybiotyki możemy podzielić na:

przeciwbakteryjne, np. penicyliny, cefalosporyny;

przeciwgrzybicze, np. gryzeofulwina;

przeciwwirusowe, np. aktynomycyna D;

przeciwnowotworowe, np. zorubicyna;

immunosupresyjne, np. takrolimus;

przeciwpierwotniakowe, np. paromomycyna;

insektycydowe, np . tetranaktyna;

przeciwrobacze, np. awermektyna;

herbicydowe, np. bialafos;

Mechanizm ich działania związany jest z oddziaływaniem na struktury i procesy życiowe

komórek patogennych poprzez:

1. hamowanie syntezyściany komórkowej, np. penicyliny, cefalosporyny;

2. zakłócenie funkcjonowania błony komórkowej, np. polimyksyny, tyrotrycyna,

makrolidy polienowe;

3. hamowanie syntezy kwasów nukleinowych, np. aklarubicyna, daktynomycyna;

4. zakłócenie syntezy białek, np. makrolidy, aminoglikozydy, tetracykliny;

5. hamowanie procesów bioenergetycznych, np. oligomycyna, antymycyna.

Wyróżniamy także antybiotyki o szerokim i wąskim spektrum działania

przeciwbakteryjnego. W lecznictwie szerokie zastosowanie znalazły antybiotyki

przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze oraz przeciwnowotworowe, a ich skuteczności zależy

od selektywnego działania toksycznego w stosunku do komórek patogennych.

Pozyskiwanie szczepów produkujących antybiotyki

Strukturę wybranych antybiotyków potwierdzono poprzez ich syntezę totalną (amfote-

rycyna B, nystatyna A). Jednakże w przypadku syntezy chemicznej tej klasy związków, ze

względu na złożoność budowy ich cząsteczek pozostaje ona metodą otrzymywania dla

niektórych tylko antybiotyków. Natomiast metodami z wyboru dla otrzymywania większości

z nich w skali przemysłowej są procesy biosyntetyczne.

Zasadniczym elementem procesów biotechnologicznych jest pozyskiwanie

odpowiednich szczepów drobnoustrojów wytwarzających antybiotyki, bowiem w obrębie

tego samego gatunku drobnoustroju istnieją szczepy o różnej aktywności antybiotycznej np.

wśród gatunku Streptomyces griseus znaleziono mutanty nie wytwarzające streptomycyny.

Mogą to być drobnoustroje pochodzące z kolekcji firm biotechnologicznych, placówek

naukowych, jak również nowe szczepy izolowane ze środowiska naturalnego (gleba, woda,

nawóz) za pomocą programów i metod skriningowych (przesiewowych), czyli

kompleksowego postępowania, którego celem jest wykrycie i izolowanie spośród dużej liczby

tylko tych drobnoustrojów lub ich metabolitów, które są przedmiotem badań oraz ocenę ich

aktywności antybiotycznej.

Etapy izolowania szczepów produkcyjnych

I. Aby wyizolować właściwe szczepy przygotowuje się rozcieńczone zawiesiny

badanej populacji w roztworze soli fizjologicznej lub roztworze Ringera, po czym wykonuje

się ich posiew na odpowiednio przygotowane podłoża, najczęściej agarowe, na płytkach

Petriego.

Stymulację wzrostu drobnoustrojów, które są przedmiotem badań dokonuje się przez:

1. temperaturę, np. ogrzanie próbki do temperatury około 100 o C (1-2 min) umożliwia

selekcję mikroorganizmów przetrwalnikujących;

2. pH, np. zwiększenie wzrostu promieniowców przy równoczesnej redukcji grzybów;

organizmów kwasolubnych, można uzyskać przez zmieszanie próbki ziemi z kredą i

inkubowanie jej w temperaturze 26 o C przez 7-9 dni;

3. natlenienie;

4. wprowadzenie do pożywek związków chemicznych, np. selektywne namnażanie

promieniowców przy zahamowanym wzroście grzybów i bakterii jednokomórkowych

uzyskuje się w obecności nowobiocyny, penicyliny G lub propionianu sodowego.

II . Kolejnym etapem w procesie pozyskiwania szczepów przydatnych do biosyntezy

są testy selekcyjne, których celem jest wstępna ocena aktywności antybiotycznej wyrosłych

kolonii i wyizolowanie form korzystnych. W testach tych wykorzystuje się zjawisko dyfuzji

antybiotyku w podłożu agarowym i ocenia się wielkość stref zahamowania wzrostu

drobnoustrojów wzorcowych. Wielkość tych stref zależy od stężenia antybiotyku

produkowanego przez kolonie testowane oraz od wrażliwości szczepu wzorcowego na dany

antybiotyk.

Powszechnie stosowane są:

a) metoda podwójnej hodowli na płytkach Petriego;

b) metoda krążków lub słupków agarowych,

które mogą być połączone z użyciem indykatora barwnego (chromogen) i w takim przypadku

obserwuje się strefy zmian zabarwienia podłoża wokół kolonii testowanych. Przykładowo,

metoda krążków agarowych posłużyła do wykrycia inhibitorów β-laktamaz - enzymów

unieczynniających penicyliny i cefalosporyny – np. kwas klawulanowy. Rolę chromogenu

spełniła nitrocefina – półsyntetyczna cefalosporyna o żółtej barwie, która w wyniku

enzymatycznej hydrolizy pierścienia β-laktamowego zmienia barwę na czerwoną.

R 1 CHN

β− laktamaza

R 1 CHN

R 3

HOOC

R 3

COOR 2

cefalosporyny

CHCH 2 OH

COOH

kwas klawulanowy

III . Po wyizolowaniu odpowiedniego szczepu, przystępuje się do prac nad

podniesieniem jego aktywności antybiotycznej, tzw. „uszlachetnianie”, czyli wyhodowaniem

mutantów charakteryzujących się korzystnymi cechami produkcyjnymi. Zwiększenie

aktywności antybiotycznej szczepu można osiągnąć przez:

1. prowadzenie hodowli drobnoustrojów w różnych warunkach środowiska, tj. w

różnych temperaturach i przy różnym pH, na pożywkach różniących się składem i

stężeniem poszczególnych składników;

2. indukowanie mutacji szczepów czynnikami fizycznymi (promieniowanie UV, X lub γ,

ultradźwięki) oraz chemicznycmi (diazometan, etylenoimina, N -metylo- N ′-nitro- N -

nitrozoguanidyna, kwas azotawy, związki alkilujące, hydantoina, kolchicyna), a

następnie selekcję mutantów;

3. rekombinacje DNA in vitro .

IV . Wyizolowany szczep produkcyjny jest następnie reprodukowany drogą hodowli

poprzez stopniowe powiększanie skali namnażania. Dzięki czemu stabilizuje się i utrwala

korzystne cechy dla danego procesu biotechnologicznego. Istotnym zagadnieniem jest

utrzymanie czystości mikrobiologicznej i genetycznej uzyskanych szczepów, co wymaga

przechowywania mikroorganizmów w warunkach zapewniających zachowanie nabytych

cech, tzn. w stanie anabiozy przez suszenie i zamrożenie lub pasażowanie.

1. W stanie zamrożenia przechowuje się drobnoustroje przez okres wielu lat w

temperaturze od –20 o C do –196 o C w zamrażarkach lub w ciekłym azocie. W celu

ochrony komórek przed zniszczeniem w trakcie zamrażania i odmrażania stosuje się

dodatek 10% glicerolu.

2. Suszenie szczepów produkcyjnych prowadzi się:

a) w temperaturze 24 o C (nie wyższej niż 40 o C) pod normalnym lub

zmniejszonym ciśnieniem w obecności środka wiążącego wodę, np. P 2 O 5 . Wysuszone

komórki, głównie szczepów wytwarzających przetrwalniki lub zarodniki, można

przechowywać w temperaturze pokojowej;

b) przez liofilizację, która umożliwia dobre zachowanie właściwości

fizjologicznych komórek, jednak może powodować ich dużą śmiertelność (temperatura,

podciśnienie).

3) Pasażowanie to proces polegający na okresowym przeszczepianiu kolonii na świeże

podłoża. Komórki drobnoustrojów przechowuje się w temperaturze +4 o C przez okres

kilku dni na podłożach stałych lub ciekłych.

łównymi producentami antybiotyków są promieniowce ( Actinomycetes ), przede

wszystkim rodzaj Streptomyces wytwarzający m.in. streptomycynę, tetracykliny,

erytromycynę, spiramycynę, antybiotyki przeciwgrzybicze o budowie makrolidów

polienowych np. nystatynę. Znane są także antybiotyki produkowane przez bakterie właściwe

( Eubacteriareles ), głównie rodzaj Bacillus , np. polimyksyny, gramicydyna. Z kolei grzyby

niedoskonałe ( Fungi imperfecti) produkują penicylinę (rodzaj Pennicillium ), cefalosporynę N,

B i C (rodzaj Cephalosporium ). Ponadto, antybiotyki wytwarzane są przez podstawczaki i

workowce a także porosty, glony oraz rośliny wyższe.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika: