MIKROBIOLOGIA - skrypt - UW 2006.pdf

(497 KB) Pobierz
Microsoft Word - MIKROBIOLOGIA _wersja duża_ - skrypt do ćwiczeń.doc
MIKROBIOLOGIA
OGÓLNA
ĆWICZENIA DLA STUDENTÓW
II ROKU
WERSJA DUŻA
INSTYTUT MIKROBIOLOGII
WYDZIAŁ BIOLOGII
UNIWERSYTET WARSZAWSKI
2006
179355350.001.png
1
SPIS TREŚCI
I. REGULAMIN PRACOWNI
2
II. ĆIZEIA
3
Ćwiczenie 1.
Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży
Podstawowe techniki mikrobiologiczne
3
Ćwiczenie 2.
Izolowanie drobnoustrojów z różnych środowisk naturalnych
Izolowanie czystych kultur
7
Ćwiczenie 3.
Wzrost hodowli bakteryjnej
11
Ćwiczenie 4.
Formy morfologiczne bakterii
13
Ćwiczenie 5.
Budowa komórki bakteryjnej
15
Ćwiczenie 6.
Metabolizm bakterii – źródła węgla, azotu i energii
17
Ćwiczenie 7.
Metabolizm bakterii – procesy oddechowe
21
Ćwiczenie 8.
Koniugacja u bakterii
24
Ćwiczenie 9.
Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami
27
Ćwiczenie 10.
Analiza mikrobiologiczna wody
30
III. KRÓTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA
ĆIZEIH
32
IV. ADDENDUM
Opis kolonii bakteryjnych
36
V. ZALECANA LITERATURA
36
2
I. Regulamin pracowni
1. W pracowni obowiązuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej białego).
2. Na stołach laboratoryjnych mogą znajdować się wyłącznie materiały potrzebne do
wykonywania ćwiczenia.
3. W pracowni zabronione jest spożywanie posiłków oraz palenie tytoniu.
4. Należy zachować daleko idącą ostrożność przy pracy z materiałem mikrobiologicznym:
a) stosować się do zasad pracy jałowej (zachować szczególną ostrożność przy pracy w
bezpośrednim sąsiedztwie płomienia palnika);
b) hodowle bakteryjne w probówkach wstawiać do statywów (nie wolno ich kłaść na
stole);
c) każdą posianą próbę dokładnie opisywać (rodzaj posiewu, inicjały osoby
wykonującej posiew, data itp.);
d) po skończeniu posiewów wyżarzać ezy, opalać głaszczki, a pipety wkładać do
specjalnych pojemników.
5. Po zakończeniu pracy należy posprzątać stół laboratoryjny, niepotrzebny już sprzęt
odłożyć na miejsce, pozostawić w porządku mikroskop.
6. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojów oraz szkło używane w trakcie pracy należy odłożyć
do specjalnie przygotowanych pojemników, po uprzednim usunięciu wszelkich napisów, i
zanieść do zmywalni.
7. Nie wolno wynosić z pracowni żadnych hodowli bakteryjnych i preparatów bez
pozwolenia.
8. Po zakończeniu pracy należy sprawdzić, czy został wyłączony gaz oraz używana aparatura
nie przeznaczona do pracy ciągłej.
9. Przed wyjściem z sali należy umyć ręce.
10. W razie jakichkolwiek problemów należy niezwłocznie zgłosić się do osoby prowadzącej
zajęcia.
3
Ćwiczenie 1
Temat: Przygotowanie i jałowienie szkła i podłoży
Podstawowe techniki mikrobiologiczne
I. Wprowadzenie
Obiektem badań w mikrobiologii są mikroskopijnej wielkości organizmy występujące
powszechnie we wszystkich środowiskach naturalnych. Badanie tych organizmów w
naturalnych warunkach bytowania jest jednak z wielu względów bardzo trudne, a często
niemożliwe. Poznanie morfologii, fizjologii, wymagań pokarmowych i środowiskowych
drobnoustrojów stało się realne dzięki stworzeniu sztucznych środowisk do ich hodowli - tzw.
podłoży (pożywek) mikrobiologicznych. Umożliwiły one hodowanie drobnoustrojów w
warunkach laboratoryjnych i uzyskanie czystych kultur - tzn. hodowli stanowiących
potomstwo jednego osobnika i będących materiałem do badań mikrobiologicznych.
Podłoża mikrobiologiczne są to mieszaniny odpowiednio dobranych składników
odżywczych, dostarczających hodowanym na nich organizmom niezbędnych pierwiastków
chemicznych oraz źródła energii. Każde podłoże musi mieć odpowiednią dla danego gatunku
wartość odżywczą, odpowiednie pH i rH oraz odpowiednią wartość osmotyczną.
Ważne jest również określenie do jakiego celu ma służyć dane podłoże - czy chodzi
nam tylko o uzyskanie hodowli, czy o wyselekcjonowanie jakiegoś określonego gatunku, czy
też o zróżnicowanie gatunków występujących w mieszaninie. Zależnie od potrzeby możemy
zastosować podłoże minimalne lub pełne , podłoże selekcyjne lub też różnicujące .
Jednym z koniecznych warunków, jaki muszą spełniać wszystkie podłoża, jest ich
sterylność , co oznacza, że muszą być pozbawione wszelkich organizmów - zarówno ich form
wegetatywnych jak i przetrwalnych.
Proces sterylizacji można przeprowadzić dwiema drogami:
- przez zabicie drobnoustrojów i ich form przetrwalnych w danym środowisku w wyniku
działania: (a) wysokiej temperatury - suszarka, autoklaw, aparat Kocha; (b) promieniowania
UV, β, γ, X; (c) związków chemicznych - tlenek etylenu lub propylenu;
- przez usunięcie drobnoustrojów i ich form przetrwalnych z danego środowiska (filtracja).
Wybór metody sterylizacji zależy od rodzaju sterylizowanego podłoża (środowiska) a
także od wyposażenia laboratorium; należy wybrać metodę nie niszczącą podłoża a
skuteczną, możliwie szybką i tanią.
Pamiętać należy, że w pracowni mikrobiologicznej sterylizujemy wszystko, czym
moglibyśmy zakazić badaną hodowlę drobnoustrojów.
1. Zasady przygotowywania podłóż
Przygotowując podłoża należy:
a) używać szkła odpowiednio wymytego i wypłukanego;
b) przestrzegać ściśle przepisów przygotowania pożywek (odważać dokładnie składniki,
zwracać uwagę na kolejność ich dodawania i na uwodnienie soli);
c) używać tylko wody destylowanej;
d) ustawiać odpowiednie pH podłoża, pamiętając o tym, że po jałowieniu w autoklawie pH
może się obniżyć;
e) do jałowienia rozlewać podłoże do kolb do objętości nie większej niż 3/4 naczynia, aby nie
wykipiało w czasie jałowienia;
f) kolby zatykać korkami z waty, zabezpieczać korki przed zamoczeniem folią aluminiową i
odpowiednio podpisywać;
g) stosować możliwie najniższą temperaturę do jałowienia.
4
2. Sposoby sterylizacji
2.1. Jałowienie szkła w suszarce
a) Odpowiednio zapakowane szkło ułożyć luźno w suszarce, aby umożliwić swobodne
krążenie powietrza.
b) Włączyć ogrzewanie. Czas sterylizacji liczyć od momentu osiągnięcia odpowiedniej
temperatury: przy 160 o C - 2 godz., przy 180 o C - 1 godz. (nie wolno przekraczać temp.
180 o C, gdyż grozi to zwęgleniem papieru i waty).
2.2. Jałowienie w autoklawie
Temperatura 100 o C nie zabija form przetrwalnych i niektórych wirusów. Wyższą temperaturę
wrzenia wody można osiągnąć po zastosowaniu nadciśnienia. W autoklawie - hermetycznie
zamkniętym kotle - stosując nadciśnienie 1 atm, uzyskuje się atmosferę nasyconej pary
wodnej o temp. 121 o C. W tej temperaturze wszystkie mikroorganizmy i ich przetrwalniki
zostają zabite w ciągu około 30 min. Czas trwania sterylizacji w autoklawie zależeć będzie od
rodzaju jałowionego materiału i jego objętości.
W autoklawie jałowi się podłoża (oprócz tych, które rozkładają się w tej
temperaturze), sól fizjologiczną, bufory, wodę destylowaną, narzędzia chirurgiczne,
opatrunki. Nie sterylizuje się tu stężonych roztworów cukrów oraz substancji łatwo
hydrolizujących.
2.3. Jałowienie w aparacie Kocha (tyndalizacja)
W aparacie Kocha sterylizuje się substancje, które ulegają rozkładowi w temp. powyżej
100 o C. Tyndalizacja polega na trzykrotnym ogrzewaniu jałowionego podłoża w temp. 100 o C
przez 30 min, co 24 godz. W czasie pierwszego ogrzewania zabite zostają formy
wegetatywne, a przetrwalniki zostają zaktywowane do kiełkowania, w wyniku działania
wysokiej temperatury i obecności pewnych związków organicznych. Proces ten jest możliwy
dzięki pozostawieniu jałowionego materiału w temp. pokojowej przez około 24 godz.
Następne ogrzewanie zabija kiełkujące przetrwalniki (które utraciły ciepłooporność). Trzecie
ogrzewanie zabija ewentualne formy wegetatywne powstałe po opóźnionym kiełkowaniu.
Ponieważ tyndalizacja opiera się na zjawisku kiełkowania przetrwalników, stosować
ją możemy tylko do substancji umożliwiających ten proces, a więc zawierających określone
związki organiczne. W ten sposób jałowi się stężone roztwory cukrów, witamin,
aminokwasów, itp.
2.4. Jałowienie przez filtrację
Filtracja pozwala na jałowienie płynów, które ulegają rozkładowi pod wpływem ciepła (np.
roztwór mocznika, surowica ). Polega ona na przepuszczaniu jałowionego płynu przez filtr o
określonej wielkości porów przy zastosowaniu nad- lub podciśnienia. Filtr zatrzymuje
bakterie na zasadzie mechanicznej i/lub fizyko-chemicznej. Filtry i oprawki do filtrów należy
przed użyciem wyjałowić (na ogół w autoklawie); sterylne musi też być naczynie, do którego
filtrujemy jałowy płyn. Do jałowienia niewielkich ilości płynu bardzo wygodne są
wysterylizowane filtry jednorazowe.

Plik z chomika:

Inne pliki z tego folderu:

Inne foldery tego chomika:

Zgłoś jeśli naruszono regulamin