WYKŁAD 5 – Biotechnologia
Listeria monocytogenes:
· bakteria modelowa w badaniach mechanizmów patogenezy bakterii
· model badawczy, bo to bakteria gramdodatnia i na bazie tej bakterii wykryto większość znanych w tej chwili mechanizmów patogenezy u bakterii
/ Organizm jest dobrym modelem poznawczym (do badań), gdy umiemy go hodować. Trzeba znaleźć podłoże hodowlane, w którym organizm optymalnie się rozwija, trzeba znać również podstawowe klucze genetyczne, którymi możemy ten organizm mutagenizować lub przeprowadzać procesy genetyczne./
· bakteria znana od bardzo dawna, ale nie należy do bardzo ostrych patogenów wewnątrzkomórkowych, występuje u ludzi o obniżonej barierze immunologicznej w sposób genetyczny, czy też u ludzi osłabionych, atakuje również nowo narodzone dzieci i płody.
· występuje bardzo często w produktach nabiałowych, wodzie i pokarmach (np.: mięso)
· po raz 1 w 1986 roku udało się na niej wykonać transformacje, (ale w bardzo skomplikowany sposób).
Transformacja:
Dla porównania E. Coli wymaga do transformacji stanu kompetentnego.
Metoda wapniowa:
· hodowle bakteryjną odwirowuje się (supernatant usuwa), a osad bateryjny zawiesza w roztworze chlorku wapnia, schładza do 4°C, a potem ogrzewa do temp. pokojowej, po czym ponownie schładza do 4°C (szoki termiczne – powodują uzyskanie stanu kompetencji, czyli struktury powierzchniowe komórki ulegają rozluźnieniu, w tym przypadku chodzi o to, że osłony komórkowe u G+ (chyba powinno być G-) mają cały szereg wiązań, w których udział biorą jony Mg2+ i to płukanie w chlorku wapnia powoduje wymianę jonów dwuwartościowych i struktura powierzchniowa ulega rozluźnieniu)
· komórka uzyskując stan kompetencji może przyjmować DNA praktycznie bez ograniczeń (DNA w kom. bakteryjnej po wniknięciu/podaniu z zewnątrz ulega degradacji przez system enzymów restrykcyjnych tnących obce DNA, dlatego praktycznie jako biorcy do transformacji używa się szczepów z upośledzonymi systemami restrykcji i modyfikacji)
W transformacji chodzi o to, żeby bakteria stała się biorcą DNA i tego DNA nie zmieniła.
(Jeżeli w przyszłości będziemy klonować transkrypcje genetyczną – wektory po wklonowaniu do nich fragmentów obcego DNA, to te komórki musza ulec namnożeniu. Biorca transformacji staje się fabryką, która produkuje/powiela DNA i pozwala namnożyć/powielić to DNA do uzyskania jego dużej ilości potrzebnej do dalszych operacji.)
U bakterii gramujemnych są jeszcze inne metody zmuszania kom. do ulegania stanowi kompetencji:
-rubidowa (sole rubidu – zmuszają kom. do stanu kompetencji)
-nadtrawianie powierzchni komórki (ściany kom.) enzymami muroinolitycznymi
( rozkład ściany kom. – nadtrawienie lipolisacharydów)
U bakterii G- jest dość łatwo i nie ma problemu z transformacja.
Gorzej jest z bakteriami G+. Różnią się one choćby w strukturze powierzchni komórki.
· Powierzchnia bakterii G+ jest stosunkowo gruba i mocno usieciowana dodatkowymi substancjami, które uszczelniają ja; dochodzą substancje: polisacharydaza + dodatkowa warstwa, która osłoni kom. z zewnątrz, kw. tejchojowe wysycają mureinę – to są substancje, które szczelnie tworzą jednolitą grubą warstwę zabezpieczającą kom. przed atakiem z zewnątrz.
· U G- na wskroś ściany kom. znajdują się poryny (zaliczane do auto membrane proteins, czyli białek błon zewnętrznych, które stanowią kanały hydrofilowe, przez które cząsteczki mogą specyficznie bądź niespecyficznie dostawać się do wnętrza warstwy wewnętrznej - periplazmy).
Jeśli chodzi o transformacje bakterii G+ to jest problem.
· Jeżeli bakteria G+ ulega autolizie w bardzo łatwy sposób to równie łatwo jest transformowalna.
Autoliza to samostrawienie komórki; kiedy np. kom. jest stara to jej system enzymatyczny zaczyna źle pracować, ulega zaburzeniom i komórka zaczyna trawić własne ściany komórkowe. Komórka jeszcze żyje, ale ściana jest nadtrawiana (rozluźniona) i DNA może do niej wnikać.
· Natomiast większość bakterii G+ transformuje się bardzo trudno i podstawowa metoda transformacji polega dla nich na pozbyciu się ich ścian kom. i przeprowadzeniu komórki w stan protoplastu (formy komórkowe pozbawione ścian kom.)
Przy takiej procedurze/technologii protoplast musi znajdować się w odpowiednim środowisku (izotonicznym) po to żeby nie uległ degradacji, bo łatwo jest komórkę zniszczyć, kiedy nie ma ona swojej ściany.
Protoplastyzację komórek G+ prowadzi się przez szereg reakcji zawiesiny kom. bakteryjnych z enzymami. Do reakcji używa się kolejno lipaz, które trawią różnorakie fosfolipidy na powierzchni kom. G+, a następnie muraminidynazy np.: lizozymu (jest w łzach i ślinie), ale ponieważ jest on od lat stosowany i naturalnie występuje w przyrodzie to bakterie nauczyły się przed nim bronić stosując różne osłony powierzchniowe ścian kom.; dlatego tez stosuje się lizostafinę – działa podobnie jak lizozym, bo również działa na wiązania w mureinie (na wiązania miedzy cukrami wchodzącymi w skład mureiny: N-acetyloglukozoaminy i kwasu muramidynowego połączonych wiązaniami 1,6 /chyba 1,4/ ). Lizostafina również działa na te wiązania, ale w innych miejscach (porównując produkty trawienia mureiny za pomocą lizostafiny i lizozymu uzyskuje się zupełnie inny wzór HPLC; wzory są charakterystyczne dla danej mureiny trawionej danymi enzymami mureinolitycznymi).
Po takim trawieniu ściana ulega degradacji i powstają protopalasty (nagie komórki). Do protoplastów dodaje się odpowiednio DNA w różnych stężeniach (np.: 1mg/ml zawiesiny bakteryjnej) i uzyskuje się transformanty (przeniesienie cząsteczki przez błonę cytoplazmatyczną nie jest żadnym problemem – aktywne przeniesienie do wnętrza). Mamy transformanta.
Problem jest taki, że żeby mogły powstać transformanty, komórka musi odbudować swoje osłony bakteryjne (musi wrócić do formy wyjściowej). Jest to proces bardzo trudny, trwa bardzo długo, wymaga bardzo bogatego podłoża i środowiska izotonicznego, czyli taka pożywka, na której wyrastać będą transformanty będzie zawierać mnóstwo substancji, które są niezbędne do wzrostu, ale na których mogą się rozwijać inne drobnoustroje, czyli niebezpieczeństwo zakażeń jest bardzo wysokie (będzie chronić antybiotyk, który jest dodany jako czynnik selekcyjny, ale szczepy, które zakażają, są oporne na antybiotyki, tym bardziej że proces odtwarzania takich transformantów trwa zwykle 5 dni (4-6dni)).
Elektroporacja:
· W ostatnich latach stosuje się inne metody transformacji np.: porażenie komórki bardzo wysokim napięciem.
· Stan kompetencji można uzyskać poprzez szoki napięciowe, ok. 20 tys. W, którymi traktuje się bakterie (bakterie są zamknięte w małych kuwetach, gdzie jest łuk elektryczny (wysokie napięcie) i wiele bakterii na drodze elektroporacji ulega transformacji).
· Ale nie wszystkie bakterie chcą być elektroporowalne, (bakteria, o której będziemy mówić, ma wielkie kłopoty z elektroporacją) niewiadomo dlaczego niektóre bakterie bardzo łatwo uzyskują stan kompetencji poprzez działanie prostych związków jak chlorek wapnia, a nie chcą uzyskać po potraktowaniu wysokim napięciem.
· Wysokie napięcie ma to do siebie, że rozrywa powierzchnie komórkową (na powierzchni komórki są duże potencjały) i robi naturalne dziury, przez które wnika DNA. ( Na tym polega elektoroporacja).
Klucz genetyczny, czyli wektory itp.
· Transformacja to nie wszystko, bo do badania danego drobnoustroju (bakterii) niezbędne są mutanty ( podstawowe narzędzie współczesnej biologii).
· Aby uzyskać mutanty trzeba mieć odpowiedni klucz genetyczny. Czyli następnym etapem przy rozpracowywaniu bakterii jest znalezienie/skompletowanie klucza genetycznego, którym będziemy się posługiwać. W przypadku bakterii G+ był większy kłopot niż w przypadku G- ( gdyby zaczęto „badania” na G+ to bylibyśmy 50 lat do tylu). Mając wzory, które były odkryte/przebadane na bakteriach G- można było je przenosić na bakterie G+ i tak się działo. Aczkolwiek nie wszystkie one pracowały, bo trzeba pamiętać o różnych systemach sekwencyjnych/restrykcyjnych, o różnych cechach tych dwóch odrębnych od siebie grup.
· Najważniejszą rzeczą było odkrycie takiego wektora, którym będziemy mogli mutagenizować. Wielkim osiągnięciem były transpozony (a właściwie wektory, które zawierały w sobie transpozony). Najczęściej do konstrukcji wektorów zawierających transpozony wykorzystywane są wektory znane z bakterii G-, które były już sprawdzone. Tu sprawdziły się nisko i średnio kopijne wektory typu pUC18 i pUC19 znane z inżynierii genetycznej, ale nie chciały się sprawdzać w bakteriach G+. Wektory, które się sprawdziły, były to wektory niskokopiowe typu pACYC184. Był to plazmid, który wykorzystywano jako pierwszy do konstrukcji wektorów przenoszących materiał genetyczny podczas transformacji do bakterii G+.
Transpozony:
· Historia: przekazywano je na drodze koniugacji; były dwa wektory – jeden właściwy z transpozonem, a drugi wspomagający (syntetyzował cały system transportujący ten właściwy plazmid na drodze koniugacji)
Klasyczny wektor, który posiada transpozony i stosowany jest do mutagenizacji inercyjnej to plazmid (4-6kb) np.: pACYC184.
Rys.1 plazmid pACYC184 (wersja z netu)
Rys.2 plazmid pACYC184 (wersja z wykładu)
Budowa plazmidu:
· oriT - miejsce, które jest przekazywane jako pierwsze
· markery oporności na antybiotyki:
- tetracyklina Tetr
- chloramfenikol Chr
(w zależności od potrzeby można wklonowywać rożne geny oporności na różne antybiotyki)
· miejsce do klonowania – to jest polilinker, w którym znajdują się najczęściej pojedyncze miejsca cięcia enzymem restrykcyjnym np.: Hind III, BamH I, EcoR I
· RTS - replikon termowrażliwy (miejsce wkolonowane z bakterii G+ )
· R - replikon własny (z bakterii G-)
Do tej konstrukcji doklonowujemy ( w miejsce do klonowania) transpozon np.: T914 (zrobił największą karierę).
· Transpozon: cząsteczka DNA, która zawiera w sobie 2 sekwencje flankujące IS (sekwencje insercyjne – w zależności od transpozonu to IS 50 lub IS 100, to sekwencje uniwersalne, które rozpoznają homologiczne miejsca na promotorze), posiada też wyznacznik – gen oporności na antybiotyk ( np.: erytromycynę).
Rys.3 transpozon
· Mamy to co mówiłem (czyli plazmid) + transpozon.
W przypadku, kiedy chcemy zastosować mutagenizację insercyjną kierunkową, specyficzną co do miejsca (a transpozon daje mutagenizację niespecyficzną co do miejsca ), proponuję w miejsce transpozonu wklonować fragment genu pożądanego do zmiany (do mutagenizacji).
· Możemy w to miejsce wklonować fragment DNA: np.: gen odpowiedzialny za wnikanie bakterii G+ do środka komórki eukariotycznej (hemolizyna). Jeśli wytniemy z tego genu fragment środkowy ok. 50-150 par zasad i wklonujemy go w miejsce do klonowania na wektorze, to ten sam wektor staje się wektorem używanym do mutagenizacji kierunkowej co do miejsca.
· Uzyskanie takiej konstrukcji nie jest proste, trzeba mieć DNA plazmidowe i DNA fragmentu. Dziś jest to sprawa prosta, bo plazmid stosunkowo łatwo namnaża się w bakteriach G- (ma replikon R, który pracuje w G-, natomiast drugi replikon TRS jest wklonowany z bakterii G+, które są wrażliwe na temperaturę 42°C).DNA uzyskuje się na drodze reakcji PCR (sekwencje flankujące gen projektuje się/syntetyzuje hybrydyzując te sekwencje z DNA i polimeraza syntetyzuje DNA)
Ten fragment genu z odpowiednimi końcówkami (w zależności od potrzeby) jest wklonowywany do plazmidu.
· Można wklonować nie tylko fragment, ale cały gen (zsyntetyzować PCR-em) i uzyskać gen (ale wcale nie hemolizyny) z końcówkami, które są potrzebne do wstawienia w odpowiednie miejsce polilinkera (najlepiej końcówki różne, bo wtedy eliminujemy ryzyko klonowania w 2 strony, bo na drodze przypadku, kiedy końcówki są takie same przy klonowaniu na tępe końce, albo te same końcówki w jednym miejscu restrykcyjnym to klonowanie odbywa się na 50% - zgodnie ze wskazówkami zegara albo odwrotnie i gen może się wstawić dowolnie; jeśli się wstawi zgodnie ze wskazówkami tak jak trzeba to jest dobrze, a jak odwrotnie to nie ma z tego pożytku, więc żeby wyeliminować te 50% wstawienia genu w odwrotnym kierunku należy tak zsyntetyzować odpowiednie końcówki na PRC, żeby zawsze wstawiał się w dobrym kierunku).
Jest jeszcze jedna możliwość oprócz transpozonu i środkowego fragmentu genu, a mianowicie cały gen ze zmienionym zapisem (czyli gen hemolizyny cały, który posiada w sobie zmieniona tylko jedna zasadę np.: zmiana kodonu trójkowego cysteiny na serynę).
Używamy tego plazmidu (pACYC184) do uzyskania mutantów np.: transpozonowych. Jest to bardzo podstawowa metoda, kiedy zaczynamy pracować z organizmami bardzo nieznanymi.
· Mutację transpozonową stosuje się wtedy, kiedy nie wiemy nic –mamy nową bakterię.
Szukamy na zgubnej drodze możliwości hodowania i wprowadzania DNA (transformacji) do tej bakterii. Pierwszą próbą uzyskania mutantów będzie metoda transpozonowa (czyli nasz plazmid).
· DNA plazmidu musi być namnożone w hodowli E. coli i wyizolowane ( w czasie wzrostu E. coli presja antybiotykowa – selekcja będzie przy wykorzystaniu chloramfenikolu ® wyrastać będą tylko te komórki po transformacji, które są oporne na chloramfenikol). Do powielania się u E. coli plazmid będzie wykorzystywał replikon 37°C (podstawowy).
· Izolujemy DNA, oczyszczamy je i transportujemy je do wybranej bakterii (musi mieć albo stan kompetencji albo być protoplastem). DNA jest w bakterii G+. Do replikacji (powielania DNA) w bakterii G+ będzie wykorzystywany replikon TRS, który pracuje w 37°C. Selekcja trasnformantów G+ będzie przy udziale tetracykliny.
· W ten sposób uzyskamy całą pulę transformantów, która nazywa się w literaturze biblioteką transpozonową (hodowla po transformacji mieszaniny transformantów pozwala nam na otrzymanie 10-20 tys. różnorakich mutantów).
· Aby uzyskać mutanta transpozonowego przesiewamy tego transformanta na podłoże pełne (na którym mu się dobrze rośnie, o pełnej zawartości substancji odżywczych) i hodujemy w 42°C (zakładamy, że mamy komórkę bakteryjną, która plazmid otrzymała i jest transformantem bakterii G+, która uzyskała ten plazmid). Hodowla w 42°C powoduje, że plazmid nie może ulegać replikacji, bo replikuje się tylko w 37°C, czyli przy presji antybiotykowej (tetracyklina) nie ma takiej możliwości, żeby powstały potomne komórki, bo są zabijane przez tetracyklinę. Ale okazuje się że po wysianiu tej hodowli na podłoża selekcyjne uzyskujemy jakieś hodowle, czyli coś przeżyło -> przeżyły te komórki, którym plazmid wrekombinował się w miejscu homologicznym (co wyznaczały sekwencje transpozonu) do DNA chromosomalnego. Inne komórki nie maja szansy przeżyć, bo w stanie wolnym transpozon (chyba plazmid) nie ma szansy się powielić – nie ma białek oporności na tetracyklinę. Tylko w przypadku wbudowania do chromosomu bakteryjnego ten szczep może przeżyć, bo wtedy plazmid korzysta z systemu replikacyjnego chromosomu – powstaną wtedy białka opornościowe.
Integracji z chromosomem ulęgają miejsca IS i transpozon pozostaje w tym miejscu, jakie sobie wybrał (plazmid ulega degradacji). Takich miejsc w chromosomie, gdzie transpozon może się wbudować jest 10 tys. W związku z tym 10 tys. potencjalnych mutantów znajduje się w hodowli. Mamy bibliotekę transpozonową.
· Wszystko jest dobrze, jeśli badamy mutanty, które są proste do selekcji i identyfikacji (np.: pokarmowe – potrzebują czegoś do wzrostu). Ale jeśli mutacja ma dotyczyć bardzo poważnej biologicznej cechy to trzeba znaleźć klucz jak zrobić mutanta.
Jeśli mamy plazmid (wektor) z fragmentem genu strukturalnego to ten plazmid po dostaniu się do komórki (po transformacji) ustawi się tak i tam, gdzie będzie szukał powinowactwa, gdzie jest naturalne powinowactwo jego genu. Czyli jeśli jest to gen hemolizyny, a ta sekwencja homologiczna hybrydyzuje z tą sekwencja, która znajduje się na chromosomie, to po hybrydyzacji następuje rekombinacja homologiczna. W tym przypadku (nie ma IS) następuje wbudowanie całego plazmidu do genomu bakteryjnego (plazmid rozsadza gen w środku jako insercja – mutanty typu insrecyjnego). Ma to tę wadę, że po insrecji powstaną elementy białka częściowego produktu genów ( uszkodzenie/insercja jest w środku, ale tak się może zdarzyć ze końcowa cześć genu jest dalej syntetyzowana i cześć aktywności genu pozostaje).
Jeśli wklonujemy cały gen ze zmienioną jedną zasadą następuje "wymiana genów" /między plazmidem, a chromosomem/ i można doprowadzić po kilku pasażach do takiej rekombinacji, że plazmid się zgubił, a wbudowaniu ulegnie tylko ten podmieniony fragment DNA (ten ze zmieniona literką/zasadą jest wbudowany na miejsce właściwego genu).
Etap, kiedy mamy mutanty (mutacje dotyczą głównych cech w cyklu życiowym – są to bardzo skomplikowane układu i znalezienie właściwych mutantów jest drogą bardzo żmudną i trudną ). Najprostsze rozwiązania w izolacji tego typu mutantów.
Jeżeli poszukujemy mutantów, które maja zaburzoną syntezę/wydzielanie białek, które wydostają się na zewnątrz -> I grupa białek bakterii patogennych ( wydzielane do podłoża).
Wtedy jest łatwo.
SDS-PAGE / Western blot
· Spośród transformantów, które wysiewamy na szalkę Petriego (pod selekcją antybiotykową) uzyskujemy jakieś kolonie. Po przeniesieniu tych kolonii na bibułę nitrocelulozową albo na membranę nylonową, przy użyciu sondy, w której jest DNA tego transpozonu, na drodze hybrydyzacji znajdujemy te kolonie, które maja na pewno transpozon w sobie. Dopiero wśród tych zaczynamy poszukiwać właściwych mutantów.
· Wiadomo, że jeśli mutacja ma dotyczyć genów w białkach wydzielanych do podłoża, to trzeba wyizolować białka z supernatantu i spróbować rozdziału tych białek na drodze elektroforezy na żelu poliakrylamidowym (SDS-PAGE). Jeżeli te białka wytrącimy (z supernatantu pohodowlanego szczepu podejrzanego o mutacje) za pomocą 10% roztworu kwasu trójchlorooctowego, naniesiemy na żel i przyłączymy pole elektryczne w aparacie do elektroforezy to białka rozdziela się w postaci prążków na żelu i otrzymamy wzory elektroforetyczne (widzimy, że w linii 3 /rys. 5A/ brakuje białka; oczywiście jednocześnie musi być przyłączony wzorzec mas cząsteczkowych – w ten sposób wstępnie stwierdzamy, że białko, którego brakuje w tym szczepie/mutancie ma np.: 60 kDa ® izolujemy/zatrzymujemy tą kolonie).
Bardzo często obraz jest bardzo zakłócony i nic nie widać ( obraz jest przykryty białkami o podobnych ciężarach cząsteczkowych - zamaskowanie).
· Jak można wykryć tego mutanta? (Bo po pierwszym żelu nie można zdecydować że tam tego białka nie ma, że to mutant).
Można zaryzykować dwa równolegle takie same rozdziały SDS-PAGE (dokładnie tak samo nałożyć, prowadzić w tych samych warunkach). Jeden z żeli wybarwić barwnikiem, który wybarwia białka (błękit Kumasiego), a na drugim z żeli zrobić Western blot, czyli przenieść całą zawartość białka z tego żelu na membranę celulozową lub nylonową.
· Western blot polega na tym, że na plastikowym postumencie (obok zbiorniczka z buforem) kładziemy bibułę tak, żeby jej brzegi umieszczone były w buforze, na to żel, na to bibułę nitrocelulozową lub nylonową, na to kładziemy cały stos papieru toaletowego (ręczniki itp.), musi to być jeszcze obciążone (np.: butelką z piwem i będzie dobrze, bo ma dobry ciężar). Bufor pobierany jest przez ten stos (higroskopia ciągnie go do góry) i przechodzi do góry. Wszystkie białka (prążki) z tego żelu zostaną przeniesione na bibułę.
Rys.4 schemat Western blot
· Jeżeli wyobrazimy sobie, że mamy możliwość uzyskania przeciwciał skierowanych przeciwko konkretnemu białku – przeciwciała monoklonalne, surowica. Bibuła, która jest odzwierciedleniem tego żelu, zostaje potraktowana najpierw odpowiednią surowicą albo odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi, a potem odpowiednio dodane zostaną przeciwciała na tą surowice to można uaktywnić (uwidocznić białka) za pomocą związków fluoryzujących lub izotopów. W ten sposób dostajemy (jeśli stosujemy przeciwciała monoklonalne przeciwko temu białku, którego mutanta poszukujemy) tylko te prążki, które będą reagować. Oczywiście tam, gdzie nie ma znacznika, to na pewno to białko, którego szukamy – mutant w tym białku /rys. 5B/. Obraz powinien być taki, że uzyskujemy jedna linie prążków ( w szczepie dzikim jest to białko, ale nie ma go w mutancie).
...
morcys1